陳仁強(qiáng)，劉 楨，胡慧玲，李林鋒，張 春#（.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川瀘州 646000）

紫花地丁是堇菜科堇菜屬植物紫花地丁Viola yedoensisMakino的干燥全草，具有清熱解毒、涼血消腫的功效[1]。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，紫花地丁具有抗菌、抗腫瘤等多種生物活性[2]。已有研究表明，紫花地丁提取物可通過靶向蛋白酶等方式抑制肺癌細(xì)胞侵襲，對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 具有抑制作用，且其黃酮類成分還具有顯著的抗氧化活性[3-5]。

香豆素類成分是植物中一類重要的次生代謝產(chǎn)物，具有抗凝血、抗菌、抗病毒等多種生物活性[6]。紫花地丁含有豐富的香豆素類成分，如秦皮乙素、秦皮甲素等[7]。本研究擬采用乙醇回流提取法提取紫花地丁總香豆素，利用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝，并初步評價所得純化物的抗氧化活性和抗腫瘤活性，旨在為該藥材的開發(fā)與利用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Cary60 型紫外-可見分光光度計、Multiskan Go 型多功能酶標(biāo)分析儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司），CKX53-SLP 型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），TS2R-LS型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司），TD-5Z型低速離心機(jī)（四川蜀科儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

紫花地丁藥材（批號2001004）購自亳州市遠(yuǎn)光中藥飲片廠，由西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與鑒定教研室莊元春副教授鑒定為真品。

秦皮乙素對照品（批號5483，純度99.3%）購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、過硫酸鉀、抗壞血酸（批號20190528，純度99.7%）均購自成都金山化學(xué)試劑有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2-苯基-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-3-氧代-1-氧（2-phenyl-4，4，5，5-tetramethylimidazoline-3-oxide-1-oxyl，PTIO）（批號分別為BTSJ18X80、BTSJ2020-0602）均購自成都潤澤本土化工有限公司；2，2′-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic） acid ammonium salt，ABTS，批號L1803054）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；CCK-8 試劑盒（批號TN618）購自北仁化學(xué)科技（北京）有限公司；Hoechst 33258 試劑盒（批號20210708）購自北京索萊寶科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試 劑 盒（批 號 分 別 為20210721、20201223）均購自南京建成生物工程研究所；水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人膽管細(xì)胞型肝癌細(xì)胞HCCC-9810、人肝癌細(xì)胞HepG2、人乳腺癌細(xì)胞MDAMB-231 和人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549 均購自中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 紫花地丁總香豆素含量的測定

采用紫外-可見分光光度法測定紫花地丁總黃酮的含量（以秦皮乙素計）。

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取秦皮乙素對照品適量，用甲醇溶解，得質(zhì)量濃度為354 μg/mL的儲備液，貯存于2～8 ℃冰箱內(nèi)，備用。取上述儲備液1 mL，以甲醇定容于10 mL 量瓶內(nèi)，得質(zhì)量濃度為35.4 μg/mL 的母液。分別取該母液0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL，用甲醇定容于5 mL 量瓶內(nèi)，使用紫外-可見分光光度計于350 nm 處測定吸光度。以秦皮乙素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、吸光度為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得秦皮乙素的回歸方程為y＝0.065 5x-0.023 6（R2＝0.999 3），提示其檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為3.54～10.63 μg/mL。

2.1.2 供試品溶液的制備 將干燥紫花地丁藥材粉碎，過四號篩后保存，備用。稱取上述粉末3.00 g，裝于無紡布內(nèi)密封，采用乙醇回流提取法提取2次，過濾，合并濾液后用乙醇定容至250 mL量瓶內(nèi)，即得供試品溶液。

2.1.3 總香豆素含量及得率的測定 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液5 mL于10 mL離心管內(nèi)，以1 000 r/min離心4 min，取上清液3 mL，置于100 mL 量瓶內(nèi)，用乙醇定容，使用紫外-可見分光光度計于350 nm 處測定吸光度，代入“2.1.1”項(xiàng)下回歸方程計算總香豆素的質(zhì)量濃度并按下式計算得率：Y＝NVC/M[式中，Y為紫花地丁總香豆素得率（mg/g），N為稀釋倍數(shù)，V為供試品溶液總體積（mL），C為總香豆素質(zhì)量濃度（mg/mL），M為紫花地丁的質(zhì)量（g）]。在此之前，按2020年版《中國藥典》（四部）“分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果均符合相關(guān)規(guī)定[8]。

2.2 紫花地丁總香豆素提取工藝的優(yōu)化

圖1 液料比、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)對紫花地丁總香豆素得率的影響

2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 按“2.1.2”項(xiàng)下方法操作，采用乙醇回流提取法提取紫花地丁總香豆素。設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，提取時間為2 h，提取2 次，考察不同液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，mL/g（下同）]對紫花地丁總香豆素得率的影響；設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，液料比為20∶1，提取2次，考察不同提取時間（1、1.5、2、2.5、3 h）對紫花地丁總香豆素得率的影響；設(shè)置液料比為10∶1，提取時間為1 h，提取2 次，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（35%、45%、55%、65%、75%）對紫花地丁總香豆素得率的影響。結(jié)果見圖1。由圖1A 可知，在液料比從15∶1 升至25∶1 的過程中，紫花地丁總香豆素得率逐漸增加；當(dāng)繼續(xù)增加液料比，其得率反而降低。當(dāng)液料比為25∶1時，紫花地丁總香豆素得率最高（20.79 mg/g）。由圖1B可知，在提取時間從1 h延長至2 h的過程中，紫花地丁總香豆素得率逐漸升高，并在2 h 時達(dá)到最大值（20.91 mg/g）；當(dāng)提取時間超過2 h后，其得率急劇下降，可能與提取時間過長會導(dǎo)致某些熱穩(wěn)定性較差的香豆素遭到破壞降解有關(guān)。由圖1C可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增加，紫花地丁總香豆素得率呈先急劇上升后緩慢下降的趨勢；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時，紫花地丁總香豆素得率最高（17.82 mg/g）。

2.2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，本研究利用Box-Behnken 設(shè)計原理進(jìn)行3 因素3 水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)：以紫花地丁總香豆素得率（Y）為響應(yīng)值，以液料比（A）、提取時間（B）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）為變量，優(yōu)化紫花地丁總香豆素提取工藝。具體的因素與水平見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果見表2。

表1 紫花地丁總香豆素提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平

采用Design Expert 8.0.6 軟件對表2 結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得多元二次回歸方程Y＝20.65-0.16A-0.17B+0.79C-0.31AB+0.54AC+0.17BC-0.46A2-0.34B2-0.17C2；隨后，對回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由表3可知，所得多元二次回歸方程的F為12.30（P＜0.01），說明該模型的擬合度良好。3 個因素中，因素C對模型有顯著影響（P＝0.000 5）；在二次項(xiàng)中，A2、C2亦對模型有顯著影響（P＜0.05或P＜0.01），而B2對模型的影響不顯著（P＞0.05）。

表2 紫花地丁總香豆素提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計與結(jié)果

表3 紫花地丁總香豆素提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的方差分析結(jié)果

為評價各因素的交互作用，本研究采用Design Expert 8.0.6 軟件繪制響應(yīng)面圖及等高線圖，結(jié)果見圖2。由圖2可知，液料比與乙醇體積分?jǐn)?shù)的交互作用較明顯，其對紫花地丁總香豆素得率的影響最大。

利用Design Expert 8.0.6 軟件求解上述多元二次回歸方程，得紫花地丁總香豆素的最優(yōu)提取工藝為：液料比25.5∶1、提取時間1.89 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)68.43%，預(yù)測紫花地丁總香豆素得率為20.79 mg/g。考慮到實(shí)際操作的可行性，本研究將最優(yōu)提取工藝參數(shù)調(diào)整為：液料比25∶1、提取時間1.9 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)68%。按此提取工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得紫花地丁總香豆素平均得率為（21.10±0.17）mg/g，RSD 為0.80%（n＝3），與預(yù)測值的相對誤差為1.49%，表明該提取工藝穩(wěn)定、可行。

2.3 紫花地丁總香豆素純化物的制備

按“2.2”項(xiàng)下最優(yōu)提取工藝制得紫花地丁總香豆素提取物，按照相關(guān)文獻(xiàn)的方法[9]，使用HPD-100型大孔吸附樹脂以50%乙醇洗脫，得到紫花地丁總香豆素純化物（淡黃色粉末，總香豆素含量以秦皮乙素計為43.8%）。

圖2 因素A、B、C 交互作用對紫花地丁總香豆素得率影響的響應(yīng)面和等高線圖

2.4 紫花地丁總香豆素抗氧化活性的評價

2.4.1 DPPH 自由基清除率 參照相關(guān)文獻(xiàn)的方法[10]，稱取DPPH 8.00 mg，加一定量95%乙醇超聲溶解并稀釋，制成濃度為0.2 mmol/L 的DPPH 溶液。分別吸取95%乙醇100 μL 和DPPH 溶液100 μL 于96 孔板中，避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測定各孔的吸光度。將紫花地丁香豆素純化物用95%乙醇溶解并稀釋至4、8、16、32、64、128、256 μg/mL，以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸作為陽性對照，分別吸取上述待測液100 μL于96孔板中，再加入的DPPH溶液或95%乙醇100 μL混合，避光反應(yīng)30 min，于517 nm 處測定各孔的吸光度，按下式計算DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率＝[A0-（A1-A2）]/A0×100%（式中，A0為95%乙醇+DPPH 溶液的吸光度，A1為待測液+DPPH溶液的吸光度，A2為待測液+95%乙醇的吸光度）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果（圖3A）顯示，與抗壞血酸比較，紫花地丁總香豆素純化物對DPPH自由基的清除能力稍弱；紫花地丁總香豆素純化物和抗壞血酸對DPPH 自由基的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為21.54、15.21 μg/mL。

圖3 紫花地丁總香豆素純化物對DPPH、ABTS 和PTIO自由基的清除情況

2.4.2 ABTS自由基清除率 在相關(guān)文獻(xiàn)方法[11]的基礎(chǔ)上稍做改進(jìn)，取7.4 mmol/L 的ABTS 乙醇溶液、2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液各2 mL，混合后，避光放置16 h，得ABTS儲備液。將上述儲備液用50%乙醇稀釋后，得ABTS 工作液（在734 nm 處的吸光度宜為0.70±0.02）。將紫花地丁總香豆素純化物用50%乙醇溶解并稀釋至4、8、16、24、32、64、128、256 μg/mL，以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸作為陽性對照，分別吸取上述待測液40 μL于96 孔板中，再加入ATBS 工作液或50%乙醇160 μL，搖勻，避光反應(yīng)8 min，于734 nm 處測定各孔的吸光度，按下式計算ABTS 自由基清除率：ABTS 自由基清除率＝[A0-（A1-A2）]/A0×100%（式中，A0為50%乙醇40 μL+ABTS 工作液160 μL 的吸光度，A1為待測液40 μL+ABTS溶液160 μL的吸光度，A2為待測液40 μL+50%乙醇160 μL 的吸光度）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果（圖3B）顯示，與抗壞血酸比較，紫花地丁總香豆素純化物對ABTS 自由基的清除能力稍弱，紫花地丁總香豆素純化物和抗壞血酸對ABTS 自由基的IC50分別為17.11、12.45 μg/mL。

2.4.3 PTIO自由基清除率 參照相關(guān)文獻(xiàn)的方法[12]，稱取PTIO 7.50 mg，溶于磷酸鹽緩沖液（pH7.4，下同）15 mL中，得質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的PTIO溶液。將紫花地丁總香豆素純化物用磷酸鹽緩沖液溶解并稀釋至4、8、16、32、64、128、256 μg/mL，以相同質(zhì)量濃度的抗壞血酸作為陽性對照，分別吸取上述待測液40 μL 于96 孔板中，再加入PTIO溶液或磷酸鹽緩沖液160 μL，搖勻，避光反應(yīng)2 h，于557 nm 處測定各孔的吸光度值，按下式計算PTIO 自由基清除率：PTIO 自由基清除率＝[A0-（A1-A2）]/A0×100%（式中，A0為磷酸鹽緩沖液40 μL+PTIO溶液160 μL 的吸光度，A1為待測液40 μL+PTIO 溶液160 μL 的吸光度，A2為待測液40 μL+磷酸鹽緩沖液160 μL的吸光度）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果（圖3C）顯示，與抗壞血酸比較，紫花地丁總香豆素純化物對PTIO 自由基的清除能力較弱，紫花地丁總香豆素純化物和抗壞血酸對PTIO自由基的IC50分別為1 422.01、37.20 μg/mL。

2.5 紫花地丁總香豆素純化物抗腫瘤活性的評價

2.5.1 細(xì)胞存活率 參考相關(guān)文獻(xiàn)的方法[13]，取對數(shù)生長期的HeLa、HCCC-9810、HepG2、MDA-MB-231、A549細(xì)胞，分別用胰蛋白酶消化，離心后調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，按每孔0.1 mL 接種于96 孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，吸出原培養(yǎng)基，每孔加入含藥培養(yǎng)基（參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將紫花地丁總香豆素純化物的質(zhì)量濃度分別設(shè)置為20、60、100、140、180、220、260、300 μg/mL）100 μL（每質(zhì)量濃度設(shè)置3個復(fù)孔），同時設(shè)置空白孔（只含培養(yǎng)基）和對照孔（含細(xì)胞和培養(yǎng)基）。常規(guī)培養(yǎng)24 h，加入CCK-8 試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)45 min，使用酶標(biāo)儀于450 nm處測定各孔的光密度（OD）并按下式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率＝（OD1-OD0）/（OD2-OD0）×100%（式中，OD0、OD1、OD2分別為空白孔、含藥孔、對照孔的OD）。結(jié)果顯示，紫花地丁總香豆素純化物對上述5種腫瘤細(xì)胞均有一定的抑制作用，其IC50分別為（113.18±15.97）、（51.17±1.72）、（134.15±11.75）、（171.83±15.27）、（93.38±4.65）μg/mL。

2.5.2 細(xì)胞凋亡形態(tài) 由“2.5.1”項(xiàng)下結(jié)果可知，紫花地丁總香豆素純化物對HCCC-9810 細(xì)胞的抑制作用相對較強(qiáng)，因此選取對數(shù)生長期的HCCC-9810 細(xì)胞，按“2.5.1”項(xiàng)下方法配制細(xì)胞懸液并接種于6 孔板中，培養(yǎng)過夜，在參考預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以0（對照組）、20、60、180 μg/mL的紫花地丁總香豆素純化物（每組設(shè)置3個復(fù)孔）作用24 h后，吸出培養(yǎng)基，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液清洗2 次，以Hoechst 33258 試劑染色后，置于倒置相差顯微鏡和熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的凋亡形態(tài)并拍照。結(jié)果（圖4）顯示，對照組細(xì)胞呈近橢圓形，染色后呈藍(lán)色且均勻、淺淡；隨紫花地丁總香豆素純化物濃度的增加，含藥組細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，細(xì)胞核開始出現(xiàn)明顯的固縮或分裂，多數(shù)細(xì)胞核呈現(xiàn)出較強(qiáng)的藍(lán)白色碎塊狀熒光，即典型的凋亡細(xì)胞核特征。

2.5.3 腫瘤細(xì)胞中LDH、SOD 含量 按“2.5.2”項(xiàng)下接種、培養(yǎng)HCCC-9810細(xì)胞，待作用24 h后，吸出培養(yǎng)基，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液清洗2次，消化，以1 000 r/min離心5 min，超聲（功率180 W，頻率40 kHz）后收集于2 mL離心管內(nèi)，使用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞中LDH、SOD含量，嚴(yán)格按照各試劑盒說明書操作。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析并使用GraphPad Prism 8軟件繪圖，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。結(jié)果（圖5）顯示，20、60、180 μg/mL的紫花地丁總香豆素純化物可顯著增加HCCC-9810 細(xì)胞中LDH 含量，并可顯著降低細(xì)胞中SOD含量（P＜0.05或P＜0.01）。

圖4 紫花地丁總香豆素純化物對HCCC-9810 細(xì)胞凋亡影響的熒光顯微圖（Hoechst 33258染色，×200）

圖5 紫花地丁總香豆素純化物對HCCC-9810 細(xì)胞中LDH和SOD含量的影響（±s，n＝3）

3 結(jié)論

本研究采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對紫花地丁總香豆素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得最優(yōu)提取工藝為液料比25∶1，提取時間1.9 h，乙醇體積分?jǐn)?shù)68%。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，該工藝穩(wěn)定、可行。

DPPH 和ABTS 為氮自由基，DPPH 自由基及ABTS自由基清除法被廣泛用于中藥提取物體外抗氧化活性研究領(lǐng)域[14]。在此基礎(chǔ)上，本研究還選擇了PTIO自由基清除法考察體外抗氧化活性。PTIO是一種常用的一氧化氮清除劑，其帶電基團(tuán)為氧原子[12]。本研究結(jié)果顯示，紫花地丁總香豆素純化物對DPPH、ABTS自由基的清除能力略弱于抗壞血酸，但對PTIO 自由基的清除能力較弱，這可能是由于PTIO 自由基清除法主要用于水相體系，而紫花地丁總香豆素水溶性較低，故其清除效果不佳。

抗腫瘤活性研究顯示，紫花地丁總香豆素純化物對HeLa、HCCC-9810、HepG2、MDA-MB-231、A549 細(xì)胞均有一定的抑制作用，其中對HCCC-9810 細(xì)胞的抑制效果最強(qiáng)，其IC50相對最低，因此進(jìn)一步考察了紫花地丁總香豆素純化物對HCCC-9810 細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)紫花地丁總香豆素純化物能促進(jìn)該細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞中的LDH 含量與細(xì)胞膜的完整性相關(guān)，凋亡細(xì)胞越多，LDH含量越高[15]。細(xì)胞中的SOD可抵抗細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，其含量變化可以反映細(xì)胞活力的高低，細(xì)胞活力越高，SOD 含量越高[16]。本研究結(jié)果顯示，隨著紫花地丁總香豆素純化物質(zhì)量濃度的增加，HCCC-9810細(xì)胞中LDH含量逐漸增加，SOD含量逐漸降低。

綜上所述，本研究優(yōu)化了紫花地丁總香豆素的提取工藝，所得提取物的純化物具有抗氧化活性和抗腫瘤活性。