代世成， 王 歡， 江連洲

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院， 哈爾濱 150030）

蛋白質(zhì)是具有一定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子，是多肽鏈經(jīng)過(guò)盤曲折疊形成的物質(zhì)。人們每天飲食中的蛋白質(zhì)主要來(lái)源于瘦肉、蛋類、豆類及魚(yú)類。大豆是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，營(yíng)養(yǎng)豐富，約含有40%蛋白質(zhì)，是一種重要的蛋白質(zhì)食品來(lái)源[1]。大豆中的大豆蛋白是一種重要的植物蛋白，因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、產(chǎn)量高、優(yōu)良的生物相容性和加工特性，被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、農(nóng)業(yè)、生物技術(shù)等領(lǐng)域。大豆分離蛋白中的主要成分7S 蛋白和11S 蛋白的三維結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。前期研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)可以通過(guò)物理、化學(xué)和酶添加的方法進(jìn)行處理，以提高蛋白質(zhì)的功能特性。但是，這些方法都存在一定的缺陷。前兩種方法對(duì)反應(yīng)條件要求嚴(yán)格，能耗高，試劑特異性弱。此外，酶解過(guò)程中容易產(chǎn)生苦味肽，降低了蛋白質(zhì)的利用率[2]。因此，結(jié)合生物活性物質(zhì)（植物多酚）對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾可能是一種合適的方法。

圖1 7S蛋白和11S蛋白的三維結(jié)構(gòu)式

多酚廣泛存在于植物中，具有極高的生物活性，被人們稱為“第七類營(yíng)養(yǎng)素”。多酚類化合物是指分子結(jié)構(gòu)中有若干個(gè)酚羥基的植物成分總稱。常見(jiàn)的植物多酚如兒茶素、原花青素、姜黃素、槲皮素的結(jié)構(gòu)式如圖2 所示。多酚類物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗炎、抗菌和抗氧化特性，能夠減少炎性反應(yīng)，在預(yù)防心血管疾病中發(fā)揮作用[3]。因此，人們對(duì)多酚作為功能性食品中的生物活性成分頗感興趣。有大量研究表明，多酚能與蛋白質(zhì)結(jié)合改變蛋白質(zhì)和多酚的結(jié)構(gòu)及其功能性質(zhì)[4]。

圖2 常見(jiàn)植物多酚的結(jié)構(gòu)式

近年來(lái)，隨著對(duì)功能性復(fù)合食品需求的增加，多酚類物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)功能特性的影響研究成為熱點(diǎn)[5]。蛋白質(zhì)和多酚是重要的食物成分，二者之間的相互作用對(duì)食品的生產(chǎn)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值起著重要作用，這些相互作用對(duì)二者的結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)會(huì)產(chǎn)生極大的影響，為了更好地了解及闡述大豆蛋白與植物多酚的相互作用，文中綜述了大豆蛋白與植物多酚發(fā)生相互作用對(duì)二者結(jié)構(gòu)和功能的影響，并列舉了一些表征二者相互作用的常用方法。這對(duì)于大豆蛋白-多酚復(fù)合物在食品加工和應(yīng)用中提供了參考，具有重要意義。

1 大豆蛋白與植物多酚的相互作用

大豆蛋白與多酚可以在不同條件下（pH，酶的添加，自由基的引入）發(fā)生相互作用，包括可逆的和不可逆的相互作用。在可逆的相互作用中，通常涉及非共價(jià)鍵，如氫鍵、疏水作用、靜電作用和范德華力。而在不可逆的相互作用中，大豆蛋白與多酚可在堿性條件下、酶的添加或自由基的引入時(shí)發(fā)生，形成共價(jià)鍵如C-N，C-S鍵[6]。

1.1 大豆蛋白與植物多酚非共價(jià)相互作用

大豆蛋白與多酚的非共價(jià)相互作用主要是蛋白質(zhì)上的氫原子受體和多酚的酚羥基結(jié)合形成氫鍵，蛋白質(zhì)上的某些氨基酸基團(tuán)或殘基也會(huì)和酚羥基或者苯環(huán)結(jié)合形成離子鍵、疏水作用、范德華力等[7]。圖3 所示為大豆分離蛋白（SPI）與兒茶素非共價(jià)作用機(jī)理，蛋白質(zhì)肽鍵上的氧原子和多酚的羥基之間可以形成氫鍵（a）。蛋白質(zhì)中的疏水氨基酸殘基可以通過(guò)疏水相互作用與多酚的非極性芳環(huán)結(jié)合（b）。并且在多酚和蛋白質(zhì)之間的靜電力中，蛋白質(zhì)上的正電荷基團(tuán)與多酚的負(fù)電荷羥基基團(tuán)相互作用（c）[8]。

圖3 SPI 與兒茶素的非共價(jià)相互作用機(jī)制

有研究表明，在很多情況下大豆蛋白與多酚的非共價(jià)相互作用中氫鍵和疏水在二者結(jié)合過(guò)程中起著重要作用，比如SPI 與表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）[2]，SPI 與兒茶素[7]，SPI 與茶多酚[9]。非共價(jià)相互作用對(duì)大豆蛋白和多酚結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)有一定影響。You等[2]發(fā)現(xiàn)EGCG的非共價(jià)修飾可以提高SPI 的功能特性，包括起泡、乳化和抗氧化性能。EGCG顯著改變了SPI 的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)了分子微環(huán)境的極性，并暴露更多的官能團(tuán)。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)花青素通過(guò)非共價(jià)作用可以顯著改變SPI 的二級(jí)結(jié)構(gòu)，形成的復(fù)合物改善了大豆蛋白產(chǎn)品的蛋白質(zhì)消化率和營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量，提高其在食品中的應(yīng)用。

1.2 大豆蛋白與植物多酚共價(jià)相互作用

圖4 是蛋白質(zhì)與多酚的共價(jià)相互作用機(jī)理，主要包括堿法、酶法和自由基接枝法，前兩種方法是多酚可以在堿性或者氧化酶存在的條件下，氧化生成醌類物質(zhì)，與蛋白發(fā)生親核加成反應(yīng)形成共價(jià)復(fù)合物（親核基團(tuán)包括氨基、巰基或者某些氨基酸殘基）。而自由基接枝法的原理是通過(guò)雙氧水和抗壞血酸的引入使體系內(nèi)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生的羥自由基進(jìn)攻蛋白質(zhì)側(cè)鏈的氨基酸殘基，生成一種活性中間產(chǎn)物，再與多酚形成共價(jià)鍵[8]。

圖4 蛋白質(zhì)與多酚的共價(jià)作用機(jī)理

與非共價(jià)相互作用相比，可能是由于共價(jià)作用不可逆，使得共價(jià)相互作用對(duì)大豆蛋白和多酚結(jié)構(gòu)和功能性質(zhì)的影響更顯著。李楊等[11]發(fā)現(xiàn)在pH 7.4、2 h和pH 9.0、24 h處理?xiàng)l件下，SPI和花青素形成共價(jià)復(fù)合物的起泡性和乳化性顯著強(qiáng)于非共價(jià)復(fù)合物。代世成等[7]通過(guò)對(duì)比SPI與兒茶素的共價(jià)和非共價(jià)相互作用，發(fā)現(xiàn)在堿法下的共價(jià)相互作用對(duì)SPI的結(jié)構(gòu)影響更顯著，更大程度地提升了SPI的功能性質(zhì)，比如起泡性和抗氧化活性。

2 常見(jiàn)表征大豆蛋白- 植物多酚相互作用的方法

多酚與大豆蛋白結(jié)合的體系是非常復(fù)雜的，因此為了更好地表征復(fù)合物的性質(zhì)和相互作用僅僅用單一的分析方法是不夠的，往往要幾種分析方法聯(lián)用來(lái)分析復(fù)合物某一性質(zhì)或結(jié)構(gòu)變化。研究多酚與蛋白質(zhì)相互作用的方法有很多種，文中主要對(duì)電泳法、紫外-可見(jiàn)吸收光譜法、圓二色光譜法、傅里葉變換紅外光譜法、熒光光譜法、生物質(zhì)譜技術(shù)和分子對(duì)接技術(shù)（見(jiàn)附表）對(duì)多酚和蛋白質(zhì)相互作用的研究進(jìn)行探討，旨在為多酚與大豆蛋白相互作用的研究提供一定參考。

附表 表征蛋白質(zhì)-多酚相互作用的方法

2.1 電泳法

電泳法分為天然聚丙烯酰胺凝膠電泳（Nativepolyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE）和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），是一種方便、快速、廉價(jià)的方法，通常用于確定蛋白質(zhì)和多糖、多酚等小分子的結(jié)合。

Native-PAGE是指電泳體系中未添加SDS和巰基乙醇等變性劑和還原劑的一種方法，由于在Native-PAGE處理過(guò)程中樣品是處于非變性狀態(tài)的，即仍保留蛋白質(zhì)本身的高活性，因此蛋白質(zhì)樣品或復(fù)合物樣品能保持原有的形狀和活性，電泳時(shí)蛋白的遷移率取決于蛋白的電荷和分子量，這有助于探究大豆蛋白和多酚結(jié)合后對(duì)大豆蛋白分子量的影響。而SDS-PAGE由于添加了SDS和巰基乙醇，SDS作為變性劑和助溶試劑，能破壞體系內(nèi)的非共價(jià)鍵。巰基乙醇作為強(qiáng)還原劑破壞二硫鍵。而大豆蛋白中含有多聚體，因此經(jīng)過(guò)SDS和巰基乙醇的處理，蛋白質(zhì)樣品會(huì)被完全還原成單體甚至是更小的亞基。SDS與蛋白質(zhì)樣品結(jié)合后會(huì)降低或消除蛋白質(zhì)分子之間的電荷差異，這就使得蛋白質(zhì)分子的遷移率只取決于蛋白質(zhì)分子大小，這有助于探究多酚對(duì)大豆蛋白亞基分子量的影響[12-13]。比如Li等[14]通過(guò)電泳法探究了乳鐵蛋白和EGCG通過(guò)非共價(jià)和共價(jià)（酶法，堿法，自由基接枝法）結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)分子量的影響差異。孫洪波等[15]通過(guò)SDS-PAGE證實(shí)了SPI-花青素非共價(jià)復(fù)合物和共價(jià)復(fù)合物的形成，SPI在堿性條件下和花青素形成了更強(qiáng)的共價(jià)交聯(lián)，這種交聯(lián)形成的作用不會(huì)被SDS和巰基乙醇阻斷。

2.2 紫外- 可見(jiàn)吸收光譜法

紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖可以反映出分子內(nèi)共軛體系的結(jié)構(gòu)信息[16]。紫外-可見(jiàn)吸收光譜法是目前研究多酚與蛋白質(zhì)相互作用較基礎(chǔ)的方法之一，該方法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快捷，檢出限低[17]。劉英杰等[18]發(fā)現(xiàn)花青素使SPI芳香族氨基酸處的微環(huán)境發(fā)生了改變，進(jìn)而誘導(dǎo)SPI多肽鏈伸展，發(fā)生解折疊。生物酶法交聯(lián)比化學(xué)堿法交聯(lián)更能促進(jìn)花青素與SPI的共價(jià)相互作用。

2.3 圓二色光譜法

圓二色光譜法常被用于測(cè)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)[19]。蛋白質(zhì)的圓二色譜分為兩段：一段遠(yuǎn)紫外區(qū)（185～245nm）；另一段是近紫外區(qū)（245～320nm）。遠(yuǎn)紫外區(qū)是肽鍵的吸收峰范圍，反映蛋白質(zhì)主鏈的構(gòu)象，包括蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)類型（α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)卷曲）及相對(duì)含量[20]。在近紫外區(qū)，譜峰可以較好地反映出蛋白質(zhì)構(gòu)象的細(xì)微變化。圓二色光譜法的特點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，而且干擾較少。同時(shí)不同的植物多酚與蛋白質(zhì)的結(jié)合具有選擇性，通過(guò)該方法可以探究不同多酚對(duì)不同蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)影響程度以及親和力的差異性。You等[2]發(fā)現(xiàn)SPI 與EGCG非共價(jià)結(jié)合后，α螺旋、β折疊和β轉(zhuǎn)角向無(wú)規(guī)卷曲轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致SPI 的二級(jí)結(jié)構(gòu)變得無(wú)規(guī)則化。由此可知，圓二色譜法可以有效地用于分析多酚與蛋白質(zhì)相互作用導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。

2.4 傅里葉變換紅外光譜法

傅里葉變換紅外光譜法是研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的另一種常用方法，這種方法的特點(diǎn)是可以測(cè)定固體或液體，需要的樣品量較少。同時(shí)可以探究體系內(nèi)是否存在疏水作用、氫鍵和靜電作用的參與[21]。趙思明等[22]發(fā)現(xiàn)EGCG可以與SPI形成氫鍵，同時(shí)隨著EGCG添加濃度的增大，SPI中β折疊的含量隨之減小，α螺旋的含量隨之增大。這表明紅外光譜法對(duì)探究大豆蛋白與多酚相互作用及對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)影響是不可缺少的研究方法。

2.5 熒光光譜法

熒光光譜法被廣泛用來(lái)探究蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)與多酚的相互作用程度大小。該方法的特點(diǎn)是靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、線性范圍寬，但該方法對(duì)環(huán)境極為敏感，酸度、污染物及溫度等干擾均會(huì)限制此方法的使用。同時(shí)熒光光譜法可以探究非共價(jià)復(fù)合物體系內(nèi)的熒光淬滅類型以及熱力學(xué)參數(shù)，并確定多酚與蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)合常數(shù)和作用力類型[23]。劉勤勤等[24]通過(guò)熒光光譜法發(fā)現(xiàn)茶多酚對(duì)大豆分離蛋白存在靜態(tài)淬滅，二者的作用力主要是范德華力和氫鍵。

2.6 生物質(zhì)譜技術(shù)

用于研究分子結(jié)構(gòu)、動(dòng)力學(xué)和分子間相互作用的常規(guī)研究方法，包括X射線結(jié)晶學(xué)、核磁共振光波譜、溶液中的光散射技術(shù)（動(dòng)態(tài)、靜態(tài)、小角度X射線散射）、圓二色性（CD）、遠(yuǎn)紫外圓二色性、振動(dòng)光譜學(xué)（傅里葉變換紅外光譜、拉曼光譜）、熒光光譜法、量熱法、凝膠色譜法和凝膠電泳。這些方法也有一些缺點(diǎn)，只能測(cè)量蛋白質(zhì)的整體結(jié)構(gòu)。比如X射線衍射需要大量的純物質(zhì)才能精確測(cè)量分子結(jié)構(gòu)。光譜法只能測(cè)量蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)和更高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。質(zhì)譜法的使用可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的這些缺點(diǎn)，并在分子水平上準(zhǔn)確地確定蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。質(zhì)譜主要用于確定原子質(zhì)量和同位素豐度。隨著高分辨率質(zhì)譜儀的出現(xiàn)，科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步拓寬了質(zhì)譜在有機(jī)化合物分析和結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用。生物質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是將分析物電離形成離子，然后通過(guò)電場(chǎng)（或磁場(chǎng)）按質(zhì)荷比（m/z）分離并分析和檢測(cè)m/z比。生物質(zhì)譜儀主要用于準(zhǔn)確測(cè)定生物大分子，如蛋白質(zhì)、核苷酸和糖，同時(shí)還提供分子結(jié)構(gòu)信息。比如電噴霧離子質(zhì)譜（ESI-MS）技術(shù)，其電離過(guò)程相對(duì)于其他方法更溫和，被廣泛應(yīng)用于研究小分子與生物大分子相互作用，比如蛋白質(zhì)和多酚的非共價(jià)相互作用，可以測(cè)定出非共價(jià)結(jié)合力的相關(guān)參數(shù)[25]。

2.7 分子對(duì)接技術(shù)

通過(guò)對(duì)多酚與蛋白質(zhì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行分析，可以得出多酚與蛋白質(zhì)之間的結(jié)合自由能、結(jié)合位點(diǎn)和相互作用力等，可以用來(lái)輔助驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Yang等[5]通過(guò)7S/11S 與EGCG 的分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白和EGCG的作用中涉及靜電作用、氫鍵和疏水作用，其中氫鍵占主導(dǎo)。You等[2]發(fā)現(xiàn)SPI與EGCG作用過(guò)程中主要是氫鍵和疏水相互作用占主導(dǎo)，這與熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致。以上實(shí)驗(yàn)均證明了分子對(duì)接對(duì)于分析多酚與蛋白質(zhì)相互作用的有效性和可行性。

3 展望

目前，雖然大豆蛋白與植物多酚的相互作用中非共價(jià)相互作用研究的比較明確，而關(guān)于共價(jià)相互作用中很多反應(yīng)機(jī)制的研究還尚不透徹，比如蛋白質(zhì)與多酚復(fù)合后構(gòu)象的改變對(duì)多酚具體結(jié)構(gòu)和功能的影響研究還不夠深入，需要從微觀和宏觀的角度采用多種分析方法去表征復(fù)合物的結(jié)構(gòu)變化和功能性質(zhì)，只有探明蛋白質(zhì)與多酚的相互作用機(jī)制，才能更好地應(yīng)用于食品體系中，從而為蛋白質(zhì)與多酚的食品加工提供相關(guān)理論指導(dǎo)。