陳月星，黃金輝，閻佩云，張曉虎

（1.商洛學(xué)院生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛 726000；2.陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，陜西 商洛 726000；3.陜西省煙草公司商洛市公司洛南縣分公司，陜西 商洛 726100）

綠原酸在國(guó)際上被公認(rèn)為“植物黃金”［1］，具有多種生物活性與藥理活性［2-4］，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健和食品加工等各個(gè)領(lǐng)域。綠原酸（Chlorogenic Acid）分子式為C16H18O9，分子質(zhì)量為354.30 Da，含有羥基和鄰二酚羥基，由咖啡酸與奎尼酸組成的縮酚酸，又名咖啡鞣酸或咖啡單寧酸［5］，廣泛存在于各類植物組織中［6-9］。

煙葉綠原酸主要包含綠原酸（3-O-咖啡?？崴幔?、隱綠原酸（4-O-咖啡?？崴幔⑿戮G原酸（5-O-咖啡?？崴幔?，10］。中國(guó)是煙草大國(guó)，煙草栽培、烘烤及卷煙生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的低廢次煙葉，目前主要采用就地焚燒、掩埋或堆棄等方法進(jìn)行處理，導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)等生產(chǎn)生態(tài)問題［11］。以往科研工作者對(duì)煙草綠原酸的基因表達(dá)進(jìn)行了較深入的研究，取得了一定的進(jìn)展［12-15］，但是有關(guān)綠原酸的提取和純化工藝研究還較少。

目前，植物中綠原酸的提取方法主要包括微波輔助提取法、溶劑提取法和超聲波輔助提取法［16-18］，對(duì)于同一植物材料，如何快速而高效地提取其中所含綠原酸是提取的關(guān)鍵問題。細(xì)胞壁是植物細(xì)胞外圍的一層特殊組織，主要成分為纖維素和果膠。選用適量的纖維素酶和果膠酶等可以破壞細(xì)胞壁的構(gòu)造，從而使得細(xì)胞壁內(nèi)的有效成分溶出，王軒等［6］采用水提法和生物酶解法比較蒲公英中綠原酸的提取效果，發(fā)現(xiàn)酶解法較水提法更好。鄧愛華等［19］采用酶法輔助法提取杜仲中的綠原酸，發(fā)現(xiàn)適量應(yīng)用纖維素酶可顯著提高綠原酸的提取率?；诖耍狙芯恳詮U次煙葉為原料，在溶劑提取法基礎(chǔ)上添加適量的纖維素酶，并通過單因素試驗(yàn)分析各因素對(duì)綠原酸提取率的影響，選取影響較大的因素進(jìn)一步通過響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期利用纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁的分解作用提高綠原酸提取效率，推動(dòng)廢次煙葉的再利用，促進(jìn)煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

材料：廢次煙葉（商洛市煙草公司提供）。

試劑：無水乙醇、3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、纖維素酶（食品級(jí)）等。

儀器：BS-15A型電子秤，YB-500A型粉碎機(jī)；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋；R-501型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；7225B型紫外可見分光光度計(jì)；DZF-6020型真空干燥箱等。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理將適量的廢次煙葉，首先沖洗干凈，把水控干，置于68℃烘箱中干燥2.0 h，然后取出粉碎過60目篩，保存于標(biāo)記好的密封塑料袋備用［20］。

1.2.2 綠原酸的提取稱量10 g預(yù)處理后的煙葉粉末放入燒杯中，邊攪拌邊加入250 mL的去離子水，攪拌0.5 h，攪拌均勻后加入2%的纖維素酶，在55℃水浴鍋中恒溫加熱1.5 h進(jìn)行酶解反應(yīng)，真空抽濾，稱取殘?jiān)? g于250 mL錐形瓶中，加入一定比例的無水乙醇，設(shè)置溫度，在超聲波清洗儀中溶解浸泡一段時(shí)間，將樣液在4 000 r/min條件下離心30 min，取上清液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至無乙醇味，即為綠原酸粗品［7］。

1.2.3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)品，將其配置成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行待測(cè)，分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL置于50 mL的圓底燒瓶中，使用移液管將去離子水加入至刻度線附近，再滴入3 mL的3，5-二硝基水楊酸（DNS）溶液，將配置好的溶液放于沸水中顯色處理5 min后取出，然后在冷水中迅速冷卻至室溫狀態(tài)，加去離子水至刻度線，振蕩混勻后在330 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，綠原酸濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.2.4 綠原酸提取率的測(cè)定按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，在波長(zhǎng)330 nm的條件下進(jìn)行測(cè)定，通過以下公式計(jì)算提取率［19］。

式中，C為樣品中綠原酸含量（mg/mL）；N為稀釋倍數(shù)；V為綠原酸提取樣液體積（mL）；M為原料的質(zhì)量（g）。

1.2.5 單因素試驗(yàn)在“1.2.2”方法的基礎(chǔ)上，對(duì)以下因素進(jìn)行考察，控制其他條件不變，分別考察浸泡溫度（50、55、60、65、70℃）、浸泡時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、浸提溫度（70、80、90、100、110℃）、料液比（1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，m/V，下同）對(duì)煙葉中綠原酸提取率的影響，利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行比色測(cè)定含量，計(jì)算得出綠原酸提取率。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果與分析，選擇對(duì)綠原酸提取率影響顯著的因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，依據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的原理，以綠原酸提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，確定最優(yōu)的提取工藝參數(shù)［21］。

1.2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)對(duì)模型預(yù)測(cè)的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)3次取平均值，與模型預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，驗(yàn)證所得工藝的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，綠原酸濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到線性回歸方程為y=0.111 5x-0.010 9，R2=0.989 1，表明在0? 18 μg/mL水平上綠原酸質(zhì)量濃度和吸光度具有良好的線性關(guān)系。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 浸泡溫度浸泡溫度對(duì)廢次煙葉中綠原酸提取率的影響如圖2所示，浸泡溫度為55℃時(shí)，綠原酸提取率最高，此后隨著浸泡溫度的升高，提取率逐漸下降，因?yàn)槊傅拇呋饔檬軠囟鹊挠绊?，?dāng)溫度超過酶的最適反應(yīng)溫度時(shí)，其空間構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變，使得酶活性降低，影響酶促反應(yīng)速率。在55℃時(shí)綠原酸提取率最高（25.4 mg/g），且極顯著高于其他處理（P＜0.01），故考慮選用浸泡溫度50?60℃為響應(yīng)面的優(yōu)化條件。

圖2 浸泡溫度對(duì)廢次煙葉綠原酸提取率的影響

2.2.2 浸泡時(shí)間浸泡時(shí)間對(duì)廢次煙葉中綠原酸提取率的影響如圖3所示，結(jié)果表明，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，廢次煙葉中綠原酸提取率呈逐漸增加的趨勢(shì)，但是當(dāng)浸提時(shí)間超過1.5 h時(shí)綠原酸提取率增加緩慢，且當(dāng)浸泡時(shí)間為2.0、2.5 h時(shí)，其綠原酸提取率與浸提時(shí)間1.5 h差異不顯著（P＞0.05），故選用浸泡時(shí)間1.0?2.0 h為響應(yīng)面的優(yōu)化條件。

圖3 浸泡時(shí)間對(duì)廢次煙葉綠原酸提取率的影響

2.2.3 浸提溫度浸提溫度對(duì)廢次煙葉中綠原酸提取率的影響如圖4所示，結(jié)果表明，在70?90℃時(shí)，隨著浸提溫度的升高，廢次煙葉中綠原酸提取率逐漸增加，當(dāng)浸提溫度為90℃時(shí)，綠原酸提取率最高為25.2 mg/g，且極顯著高于其他處理（P＜0.01），當(dāng)提取溫度為80、100℃時(shí)，綠原酸提取率之間的差異未達(dá)到顯著水平，故選用浸提溫度80?100℃為響應(yīng)面的優(yōu)化條件。

圖4 浸提溫度對(duì)廢次煙葉綠原酸提取率的影響

2.2.4 料液比料液比對(duì)廢次煙葉中綠原酸提取率的影響如圖5所示，結(jié)果表明，隨著提取液比例的增大，廢次煙葉中綠原酸提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶25時(shí)，綠原酸提取率最高為25.1mg/g，且與其他處理差異極顯著（P＜0.01），故選用料液比1∶20?1∶30為響應(yīng)面的優(yōu)化條件。

圖5 料液比對(duì)廢次煙葉綠原酸提取率的影響

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)結(jié)果分析顯示，所考察的4個(gè)單因素均顯著影響廢次煙葉綠原酸提取率，因此這4個(gè)因素全部進(jìn)入響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素和水平

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，其中第29處理組合（A0B0C0D0）綠原酸提取率最高，為25.87 mg/g。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，以綠原酸提取率作為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)各試驗(yàn)因素進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程式為Y=25.70+0.62A-0.14B+0.74C+0.47D-0.33AB-0.077AC-0.26AD-0.79BC-1.08BD-0.14CD-1.24A2-2.47B2-2.85C2-7.13D2。

對(duì)回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果如表3所示，P＜0.01，失擬項(xiàng)P＞0.05，說明回歸方程顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，浸泡時(shí)間（A）和料液比（D）對(duì)對(duì)綠原酸提取率影響顯著（P＜0.05），浸提溫度C、A2、B2、C2和D2對(duì)綠原酸提取率影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01），浸泡溫度B和料液比D的交互作用達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。各因素對(duì)廢次煙葉中綠原酸的提取率的影響程度為浸提溫度（C）＞浸泡時(shí)間（A）＞料液比（D）＞浸泡溫度（B）。

表3 回歸模型方差分析

響應(yīng)面分析結(jié)果顯示，最佳工藝條件為浸泡時(shí)間1.46 h，浸泡溫度55.68℃，浸提溫度92.5℃，料液比為1.00∶25.16，預(yù)測(cè)提取率為25.809 mg/g。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了便于試驗(yàn)操作，將響應(yīng)面優(yōu)化工藝參數(shù)設(shè)置為浸泡時(shí)間1.5 h，浸泡溫度55℃，浸提溫度92℃，料液比1∶25，此結(jié)果與響應(yīng)面試驗(yàn)第29處理組合基本一致。依此工藝參數(shù)進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，取其平均值，綠原酸提取率為25.863 mg/g，與預(yù)測(cè)值（25.809 mg/g）基本一致。

3 討論與結(jié)論

縮酚酸中咖啡酸的羧基和奎尼酸的羥基是構(gòu)成綠原酸的主要成分，也是植物組織細(xì)胞中通過莽草酸過程組合的一種名為苯丙素類的物質(zhì)，其中結(jié)構(gòu)式中含有鄰二酚羥基、酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚［17］，因此，在進(jìn)行單因素的提取試驗(yàn)中，綠原酸的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，導(dǎo)致浸提溫度的控制需掌握到最佳，長(zhǎng)時(shí)間的高溫環(huán)境致使分解嚴(yán)重，損失率逐步上升。在熱提過程中，由于綠原酸屬于多酚，而多酚可能會(huì)和蛋白質(zhì)、多糖、果膠等物質(zhì)形成沉淀物析出［18］。因此，在浸提溫度上要嚴(yán)格把控，試驗(yàn)證明，浸提溫度在90℃將達(dá)到最佳狀態(tài)。進(jìn)一步通過響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)4個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為浸泡時(shí)間1.5 h，浸泡溫度55.5℃，浸提溫度92℃，料液比1∶25，該條件下綠原酸提取率為25.863 mg/g，本試驗(yàn)的工藝條件提取綠原酸簡(jiǎn)便快速、綠色環(huán)保、效率高，可為廢次煙葉的綜合利用提供理論依據(jù)。

此外，綠原酸與煙草質(zhì)量和抗逆性緊密相關(guān)，已引起許多研究者的重視［22］，但是煙株各組織部位綠原酸含量各不相同，提取方法也不同，如何高效快速地提取煙株中的綠原酸，以及如何提高其純度有待進(jìn)一步研究。