吳亞姍，楊平貴，付華龍，阿龍呷，陳明華，毛進(jìn)彬，龐 倩，周明亮*

（1.四川省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，四川 成都 610041；2.四川省草原科學(xué)研究院，四川 成都 611731；3.四川省甘孜州畜牧站，四川 康定 626000）

瑪格綿羊是分布于四川省甘孜藏族自治州得榮縣瑪格山一帶的肉毛兼用型綿羊，是近年來在四川藏區(qū)挖掘出的一種小型綿羊。該綿羊群體體格較小，結(jié)構(gòu)緊湊，體軀呈圓桶狀；頭大小適中，頸短；胸寬和胸深適度，背腰平直，體軀勻稱；尾短小，呈圓錐形；蹄質(zhì)堅實；公羊睪丸發(fā)育良好，大小適中，母羊乳房勻稱，柔軟而有彈性；公、母羊頭、頸、耳部毛色為黑色，其余部位為白色，少部分個體四肢有黑色斑點。公、母羊多為無角，公羊無角個體占72.4%，母羊無角個體占77.0%；有角的個體角小，呈黑色，公羊角略粗大，母羊角細(xì)而短。

微衛(wèi)星標(biāo)記（Microsatellite）是由2～6 bp的小片段組成核心序列，重復(fù)10～20 次的簡單序列，廣泛分布于生物體整個基因組，平均每10 kb 就會出現(xiàn)一個。因其在基因組分布廣、數(shù)量多、多態(tài)性豐富、易于檢測、呈共顯性遺傳、所受選擇壓力小等優(yōu)點，被用于綿羊或山羊群體的遺傳多樣性評價、親子鑒定、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建及QTL 定位等研究領(lǐng)域［1-3］。本次試驗選擇分布于綿羊26條常染色體和X染色體上的30個微衛(wèi)星標(biāo)記，采用毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因分型，探討瑪格綿羊這一資源群體的遺傳雜合性和遺傳多樣性，以期為該資源群體的遺傳多樣性評價和遺傳背景研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血液樣品 試驗羊只來源于瑪格綿羊的主產(chǎn)區(qū)得榮縣瑪格山一帶。采用頸靜脈采血的方法采集3～4 mL血液樣品，注入真空采血管（含抗凝劑EDTA·K2）中，顛倒混勻，低溫保存運回實驗室，-20 ℃長期保存，備用。

1.2 DNA提取 采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的TIANamp Genomic DNA Kit 進(jìn)行DNA 提取，按操作說明書提取基因組總DNA，提取的基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢查合格后，置于-20 ℃保存，備用。

1.3 微衛(wèi)星標(biāo)記的引物 聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）和國際動物遺傳學(xué)（ISAG）聯(lián)合推薦用于綿羊群體遺傳多樣性分析的的微衛(wèi)星標(biāo)記以及從美國肉畜中心（USDA-MARC）微衛(wèi)星標(biāo)記數(shù)據(jù)庫中篩選的標(biāo)記，共30 個微衛(wèi)星標(biāo)記，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫驗證引物序列的準(zhǔn)確性。用5′-ROX、5′6-FAM（FITC）、5′-TAMRA 和5′-HEX 進(jìn)行熒光標(biāo)記。引物合成及熒光標(biāo)記均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4 PCR 擴(kuò)增及等位基因分型 PCR 擴(kuò)增體系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 mmol∕L上下游引物各1 μL，DNA 模板1 μL，用超純水補(bǔ)充至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56～63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min，擴(kuò)增產(chǎn)物于8 ℃保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行等位基因分型。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 用Cervus3.0 軟件分析微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因數(shù)（Na）、等位基因（Allele）、等位基因頻率（Allelefrequency）、多態(tài)信息含量（PIC）、觀察雜合度（Ho）和期望雜合度（He）等。使用Popgen32 軟件分析有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon 指數(shù)（I）、近交系數(shù)（Fis）和Hard-Weinberg（哈溫）平衡（HWE）。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及等位基因分型 采集瑪格綿羊60 個個體的血液樣品，提取DNA 采用1.5%凝膠電泳檢測，結(jié)果條帶清晰，可用于后期PCR 擴(kuò)增試驗。擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物用毛細(xì)管凝膠電泳進(jìn)行等位基因分型及統(tǒng)計分析。

2.2 等位基因及其頻率 瑪格綿羊群體的30個微衛(wèi)星標(biāo)記共有251 個等位基因，每個標(biāo)記的等位基因數(shù)為4～14個，平均為8.37個等位基因，等位基因的堿基變化為76～280 bp，見表1。每個標(biāo)記都有自己的主效等位基因，一般為2～4 個，但OARHH35 標(biāo)記只有一個主效等位基因，其119 bp等位基因的頻率達(dá)到0.775 0，而OARHH47和OarVH72標(biāo)記的主效等位基因數(shù)達(dá)到6個。

表1 30個微衛(wèi)星標(biāo)記的等位基因及其頻率

2.3 瑪格綿羊群體的多樣性分析 采用Cervus3.0 和Popgen32 軟件分析瑪格綿羊群體的有效等位基因數(shù)、觀察雜合度、期望雜合度、多態(tài)信息含量、Shannon 指數(shù)、Fis 和Hard-Weinberg 平衡，結(jié)果見表2。30 個微衛(wèi)星標(biāo)記的有效等位基因數(shù)在1.494 1～9.045 2 之間，平均為4.013 3；觀察雜合度在0.217～0.850之間，平均為0.605 5；期望雜合度在0.333～0.897之間，平均為0.701 8。

表2 瑪格綿羊30個微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性

瑪格綿羊群體的PIC 在0.310～0.879 之間，平均為0.664。根據(jù)Botstein等［4］提出的衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo)，OARHH35、OarAE129、MAF33、OarCP38和AGLA29 5個微衛(wèi)星標(biāo)記的PIC 范圍為：0.5＞PIC≥0.25，屬于中度多態(tài)信息含量；BM6506、BM1824 和OarFCB128等26個微衛(wèi)星標(biāo)記的PIC≥0.50，屬于高度多態(tài)信息含量，該群體的平均PIC 含量為高度多態(tài)信息含量，揭示該群體具有豐富的遺傳多樣性。

BM6506、OARHH35、OarAE129、MAF33、OarCP38 和AGLA29 6 個標(biāo)記的Shannon 指數(shù)小于1，而其他24 個標(biāo)記均大于1，平均為1.644 6，群體在0.689 3～2.333 2 之間；標(biāo)記BM6506 的群體內(nèi)近交系數(shù)（Fis）最高，達(dá)到了最高（為0.630 4），標(biāo)記HEL10 的Fis 最低（為-0.061 5），平均為0.129 2，群體內(nèi)存在弱近交；30個標(biāo)記中有6個標(biāo)記極顯著偏離哈溫平衡（HWE），1 個標(biāo)記顯著偏離哈溫平衡，23個標(biāo)記處于哈溫平衡之中。

3 討論

雜合度（H）又稱基因多樣性，反映群體在多個位點上的遺傳變異情況，是被檢測遺傳標(biāo)記多態(tài)性的度量單位，一般認(rèn)為一個群體的雜合度大于0.5，意味著該群體沒有受到高強(qiáng)度的選擇，遺傳多樣性比較豐富。本試驗中瑪格綿羊群體的30個微衛(wèi)星標(biāo)記的觀察雜合度為0.217～0.850，有BM6506、BM1824、OARHH35、OarAE129、LSTS5、OarCP38 和BMS631 這7 個標(biāo)記的觀察雜合度小于0.5，在這些標(biāo)記位點存在較強(qiáng)的選擇，有24個標(biāo)記在0.5～1.0 之間，群體的平均觀察雜合度為0.6055；群體的期望雜合度為0.333～0.897，OARHH35、OarAE129 和OarCP38 這3 個標(biāo)記的期望雜合度低于0.5，群體的平均期望雜合度為0.701 8，表明瑪格綿羊群體具有較高的多樣性。

PIC 是群體內(nèi)遺傳變異的量度指標(biāo)，可用來描述微衛(wèi)星位點的變異程度，我國綿羊的遺傳多樣性分析運用微衛(wèi)星標(biāo)記，統(tǒng)計其PIC 來評價群體的多樣性，總體而言，我國綿羊群體的多樣性比較豐富。趙冰茹等［5］選用9個微衛(wèi)星標(biāo)記探討了新疆4 個地方綿羊群體的遺傳多樣性，得出巴音布魯克羊、巴爾楚克羊、柯爾克孜羊和多浪羊群體的PIC含量分別為0.73、0.66、0.72和0.71，揭示新疆地方綿羊群體具有豐富的多樣性；王秀蓉等［6］采用微衛(wèi)星標(biāo)記分析了青海高原型西藏羊4個群體的多樣性，其群體PIC 含量分別為0.60、0.66、0.66和0.68。

4 結(jié)論

從瑪格綿羊群體30 個微衛(wèi)星標(biāo)記中共檢測到251個等位基因，每個標(biāo)記的等位基因數(shù)為4～14 個，平均8.37 個，有效等位基因數(shù)在1.494 1～9.045 2 之間，平 均 為4.013 3；Shannon 指數(shù) 在0.689 3～2.333 2之間，平均為1.644 6；7個標(biāo)記顯著或極顯著偏離哈溫平衡，23個標(biāo)記處于哈溫平衡；觀察雜合度在0.217～0.850 之間，平均為0.605 5，期望雜合度在0.333～0.897之間，平均為0.701 8；PIC 在0.310～0.879 之間，平均為0.664。本研究揭示了瑪格綿羊群體的遺傳多樣性豐富，有進(jìn)一步開發(fā)利用的價值。