白云華，王立賢，陳華林，麻 柱，楊 超，路永強(qiáng)，邢 凱，韋家周，陳林生

（1.北京奶牛中心，北京 朝陽(yáng) 100101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，北京 海淀 100193；3.北京市畜牧總站，北京 朝陽(yáng) 100101；4.北京農(nóng)學(xué)院，北京 昌平 102206；5.廣西農(nóng)墾西江乳業(yè)有限公司，廣西 貴港 537100；6.廣州市穗新牧業(yè)有限公司，廣東 增城 511335）

牛病毒性腹瀉（BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）感染引起的一種復(fù)雜的呈現(xiàn)多種臨床表現(xiàn)的疾病。不同品種、年齡段的牛均可感染BVDV，以12月齡以下的犢牛最為易感［1-2］。由于國(guó)內(nèi)BVDV傳播廣泛，加上其致病機(jī)理復(fù)雜，目前尚無(wú)有效的藥物治療，而疫苗免疫存在引發(fā)胎兒感染等風(fēng)險(xiǎn)，給本病的防治帶來(lái)困難。目前最有效的方法是使用高效消毒劑殺滅病原，防止BVDV 在牛群中傳播。金百麥環(huán)境凈化劑（Genbiom）是一種全新的固態(tài)環(huán)境凈化劑，主要成分為二氧化鈦［3］。本試驗(yàn)旨在通過(guò)體外試驗(yàn)驗(yàn)證Genbiom對(duì)BVDV的殺滅效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 BVDV分離株（1×104.25TCID50）由北京百凈?？萍及l(fā)展有限公司提供，MDBK 細(xì)胞（牛腎細(xì)胞）購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)；MEM 培養(yǎng)基、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素雙抗、胰酶購(gòu)自GIBCO公司，Genbiom 干粉由北京百凈?？萍及l(fā)展有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 MDBK 細(xì)胞的準(zhǔn)備 將MDBK 細(xì)胞以0.5～2×104∕孔鋪到96 孔板內(nèi)，培養(yǎng)約12 h（即長(zhǎng)滿板底約70%時(shí)），將10% FBS DMEM 培養(yǎng)基換成含2% FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，用于抗病毒效果評(píng)價(jià)。

1.2.2 Genbiom 對(duì)MDBK 細(xì)胞最大無(wú)毒用量的探索 分別無(wú)菌稱取25、50、100、200、400 mg 和800 mg 已高壓滅菌處理的Genbiom 于1.5 mL 離心管中，然后分別加入500 μL 細(xì)胞培養(yǎng)液，振蕩混勻，取50 μL 加入上述準(zhǔn)備好的含MDBK 細(xì)胞的細(xì)胞板中，培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)胞病變情況（CPE），無(wú)細(xì)胞病變的最高量為該產(chǎn)品對(duì)MDBK細(xì)胞的最大無(wú)毒量。

1.2.3 Genbiom 對(duì)BVDV 最低有效量的測(cè)定 分別無(wú)菌稱取25、50、100、200、400 mg 和800 mg 已高壓滅菌處理的Genbiom于1.5mL離心管中，然后分別加入100 μL BVDV 病毒液（1×104.25TCID50），振蕩混勻，室溫下充分作用30 min 后，加入500 μL DMEM培養(yǎng)基，反復(fù)振蕩混勻，靜置5 min后，5 000 r∕min 4 ℃離心5 min，取50 μL 上清接種于長(zhǎng)滿MDBK 細(xì)胞單層的96 孔細(xì)胞板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，觀察細(xì)胞產(chǎn)生CPE的情況。同時(shí)分別設(shè)病毒陽(yáng)性組和無(wú)病毒的空白對(duì)照組，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。不產(chǎn)生CPE的藥物最小使用量為該產(chǎn)品的最低有效量。

1.2.4 Genbiom 對(duì)BVDV 最短作用時(shí)間的測(cè)定 無(wú)菌稱取Genbiom 干粉，按1.2.3 方法測(cè)定最低有效量，與BVDV 病毒液（1×104.25TCID50）作用，室溫下分別靜置5、10、30、60 min，使Genbiom干粉與100μL病毒液充分作用。之后加入500μL DMEM 培養(yǎng)基，反復(fù)振蕩混勻，靜置5 min 后，5 000 r∕min 4 ℃離心5 min，取50 μL 上清接種于長(zhǎng)滿MDBK 細(xì)胞單層的96 孔細(xì)胞板，同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。將MDBK細(xì)胞以0.5～2×104∕孔鋪到96孔板內(nèi)，培養(yǎng)約12 h（即長(zhǎng)滿板底約70%時(shí)），將10% FBS DMEM 培養(yǎng)基換成含2%FBS 和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，用于抗病毒效果評(píng)價(jià)。

將接種后的96 孔細(xì)胞板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，記錄細(xì)胞發(fā)生CPE的情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 Genbiom對(duì)MDBK細(xì)胞的最大無(wú)毒用量 不同用量的Genbiom 對(duì)MDBK 細(xì)胞的毒性作用不同，試驗(yàn)結(jié)果（表1）顯示，MDBK 細(xì)胞對(duì)Genbiom的最大耐受劑量為100 mg。

表1 Genbiom對(duì)MDBK細(xì)胞的最大無(wú)毒用量

2.2 Genbiom對(duì)BVDV的最低有效量 Genbiom最低有效量檢測(cè)結(jié)果如表2所示。25 mg Genbiom與病毒作用后，加入MDBK細(xì)胞培養(yǎng)72 h，在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞大量死亡，出現(xiàn)BVDV典型的細(xì)胞病變，MDBK 細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙增大，少數(shù)細(xì)胞開(kāi)始脫落。當(dāng)50 mg和100 mg Genbiom與病毒相互作用30 min 后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)均正常，未見(jiàn)到明顯的細(xì)胞死亡及細(xì)胞變圓、胞漿空泡化等細(xì)胞病變；陰性對(duì)照組的細(xì)胞生長(zhǎng)正常，而陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞大量死亡，陰、陽(yáng)性對(duì)照組均成立。根據(jù)以上結(jié)果可以得出，50 mg 為Genbiom 對(duì)BVDV 的最低有效劑量，200 mg 以上則可產(chǎn)生明顯的CPE。

表2 Genbiom最低有效量測(cè)定

2.3 Genbiom 最短作用時(shí)間 Genbiom 殺滅BVDV 最短作用時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果如表3 所示。50 mg Genbiom與病毒作用10 min后，加入MDBK細(xì)胞培養(yǎng)72 h，在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞出現(xiàn)了死亡、變圓等病變。而Genbiom 作用30 min 和60 min，與陰性對(duì)照組相比，均無(wú)細(xì)胞病變。本試驗(yàn)的陰、陽(yáng)性對(duì)照組均成立，最終確定Genbiom殺滅BVDV的最短作用時(shí)間為30 min。

表3 Genbiom對(duì)BVDV的最短作用時(shí)間

3 討論與結(jié)論

Genbiom環(huán)境凈化劑采用國(guó)際先進(jìn)的納米光催化技術(shù)，利用二氧化鈦（TiO2）半導(dǎo)體效應(yīng)，材料表面吸收氧和水分，產(chǎn)生降解環(huán)境污染物和抑菌殺菌的作用。TiO2在催化過(guò)程中具有較強(qiáng)的抑菌滅菌作用，可用作與食品直接接觸的包裝材料和食品添加劑［4］。納米二氧化鈦因?yàn)槠淞己玫目咕芰?，已?jīng)作為醫(yī)療植入物在臨床中得到應(yīng)用［5］。

本研究評(píng)估了Genbiom對(duì)BVDV的體外殺毒效果，重點(diǎn)探究了Genbiom 對(duì)BVDV 的最低有效量和最短作用時(shí)間，為環(huán)境殺滅BVDV 提供了一種可行且敏感的方法。Genbiom適用于養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境及人員消毒、水體消毒和家庭日常消毒等，是一種安全高效、環(huán)保的環(huán)境凈化劑。

4 結(jié)論

本研究就Genbiom干粉對(duì)BVDV的殺滅效果進(jìn)行了初步探究，雖然病毒在不同細(xì)胞株傳代的易感性不同，結(jié)果可能會(huì)有略微差別，但是本次試驗(yàn)表明Genbiom 對(duì)BVDV 具有良好的殺滅效果，其最低有效量為50 mg，最短作用時(shí)間為30 min。鑒于Genbiom 良好的殺毒滅菌能力，建議用于養(yǎng)牛場(chǎng)消毒及環(huán)境凈化。