楊 光，楊 旭，訾晶晶，于建杰，郭 宏，丁向彬，劉新峰,2*，張林林*

(1.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2.寧夏大學 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，銀川 750021)

動物的肌肉發(fā)育包括胚胎期和出生后肌纖維的增殖和肥大兩個方面，是一個長期發(fā)展的生物過程并由眾多基因協(xié)作調(diào)控。部分品種的牛(如比利時藍牛)，其肌肉增大是由于肌肉纖維顯著增多，而胰島素樣生長因子(IGFs)則能夠促進成肌細胞的增殖；小鼠在缺失肌生成抑制素基因(-8)后，肌肉纖維數(shù)量增多，進而增強其骨骼肌質(zhì)量。骨骼肌是肌肉的重要組成部分，存在于生物體的各種組織中，也是呼吸、代謝等生理過程中不可或缺的組成要素。骨骼肌的生長發(fā)育伴隨著眾多基因的共同調(diào)控，骨骼肌衛(wèi)星細胞是肌源性干細胞，在動物機體受到損傷時，可以增殖、分化為新的肌纖維、形成新的肌肉組織。在畜牧生產(chǎn)過程中，動物的產(chǎn)肉性能是決定經(jīng)濟指標的重要因素之一。從不同層面研究肌肉的生長發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有助于了解和提升動物的產(chǎn)肉性能。

核不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclear ribonucleoproteins,hnRNPs)是一類由RNA聚合酶Ⅱ產(chǎn)生并且與轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的核蛋白，是一類參與了多種重要生命活動的RNA結(jié)合蛋白。HNRNPs家族成員約有20多個，按分子量大小命名從A到U，主要成員包括 hnRNPA、hnRNPA/B、hnRNPC 等，hnRNPs的生物學功能較為廣泛，它能夠利用其自身特有的結(jié)構(gòu)同前體mRNA相結(jié)合，以兩者復(fù)合體的形式參與mRNA的剪接、翻譯、mRNA的穩(wěn)定以及轉(zhuǎn)錄等調(diào)控過程，還有少部分未命名的成員由于表達較少并且不具備與前體mRNA結(jié)合的能力從而負責協(xié)助其他hnRNPs完成部分生物學功能。hnRNP蛋白能夠進行翻譯后修飾，從而使生物活性及亞細胞定位發(fā)生改變。其在基因表達調(diào)控中同樣發(fā)揮重要作用，研究表明許多hnRNPs參與癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，例如hnRNP A1在肺癌樣本中的表達顯著增加，并與腫瘤的增殖有關(guān)；hnRNP A2/B1可以顯著提升癌細胞的增殖從而促進人乳腺癌細胞的侵襲；hnRNP C能夠調(diào)節(jié)乳腺癌的致癌基因等。在肌肉發(fā)育方面，hnRNP A1能夠調(diào)控小鼠肌肉相關(guān)基因的表達和選擇性剪接，從而影響肌肉收縮；降低小鼠骨骼肌中hnRNP A1的表達能夠通過抑制糖原合成影響該組織的代謝特性和胰島素敏感性；hnRNP H在胚胎間充質(zhì)細胞中高表達，并且在胚胎間充質(zhì)細胞向平滑肌細胞分化時，hnRNP H的表達顯著降低，表明hnRNP H在平滑肌的生成調(diào)節(jié)中具有重要作用；hnRNP L對肌源性分化具有重要作用，并能夠作為潛在的治療靶點調(diào)節(jié)肌強直性營養(yǎng)不良病等；HNRNPAB作為hnRNPs家族的核心蛋白，由兩段RNA識別基序、一段RGG盒以及兩段富含甘氨酸結(jié)構(gòu)域的輔助區(qū)域構(gòu)成，其中的RNA識別基序約由90～100個氨基酸組成，能夠與Pre-mRNA的3′非翻譯(3′UTR)區(qū)域結(jié)合，而富含甘氨酸的區(qū)域在核定位功能上具有重要作用。HNRNPAB在生物學功能上主要參與調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)運、代謝及剪切等過程，并且與諸多惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。但HNRNPAB參與動物骨骼肌發(fā)育的研究鮮有報道?；诖?，本研究利用牛骨骼肌衛(wèi)星細胞體外誘導(dǎo)成肌分化模型，通過干擾牛骨骼肌衛(wèi)星細胞中的表達，研究HNRNPAB對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞體外成肌分化的作用，為進一步挖掘影響牛肌肉發(fā)育的基因奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

牛骨骼肌衛(wèi)星細胞由天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室分離凍存。

1.2 主要儀器

熒光顯微鏡(Leica)；CO培養(yǎng)箱(SANYO)；脫色搖床(IKA)；酶標儀(Thermo-scientific)；垂直電泳槽(Bio-Rad)；LightCycle 96 實時熒光定量PCR儀(Roche)；PowerPac Basic電泳儀；ChemiDocImaging System(Bio-Rad)等。

1.3 主要試劑

胎牛血清(FBS)和馬血清(HS)(Gibco, USA)；PBS 緩沖液、0.25%胰蛋白酶(Solarbio, 北京)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone, USA)；EDU細胞增殖檢測試劑盒(銳博，廣州)；RNA快速提取試劑盒(艾德萊，北京)；BCA試劑盒(康為世紀，北京)；PAGE凝膠快速制備試劑盒(雅酶生物，上海)；鼠抗GAPDH，羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗(中杉金橋，北京)；兔抗 HNRNPAB(Abcam, USA)；PrimeScript II 1 st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa，大連)等。

1.4 方 法

1.4.1 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的復(fù)蘇、傳代及誘導(dǎo)分化 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞體外誘導(dǎo)成肌分化模型的建立參考天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室建立的方法，液氮中取出細胞，37 ℃水浴快速搖晃使細胞復(fù)蘇，用等體積的增殖培養(yǎng)基(20%FBS+80%DMEM)中和，立刻轉(zhuǎn)移到離心管中離心10 min(1 000 r·min)，離心后棄上清，加入3 mL增殖培養(yǎng)基重懸，均勻接種于60 mm細胞培養(yǎng)板，當細胞融合度達到80%，細胞量約為1×10時傳代，用胰酶進行消化，增殖培養(yǎng)基中和以終止消化，差速離心收集沉淀，加入增殖培養(yǎng)基重懸后接種于6孔和24孔板中培養(yǎng)，24 h后收取增殖期細胞(GM期細胞)。細胞融合度達到80%～90%后，換分化培養(yǎng)基(2%HS+98%DMEM)進行體外誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)24、48、72 h后收取分化期第1(DM1)、2(DM2)、3(DM3)天的細胞。

1.4.2干擾效果檢測 根據(jù)的CDS區(qū)序列設(shè)計干擾RNA(序列為：CCAAAGAGGTTTATCAACA)，由廣東銳博公司合成。將細胞培養(yǎng)于24孔板和6孔板中，設(shè)置試驗組和對照組，每組3個重復(fù)，細胞融合度達80%，細胞量約為1×10時參考Lipofectamine3000說明書轉(zhuǎn)染si-HNRNPAB及對照。轉(zhuǎn)染24 h后收取增殖期(GM)細胞，同時更換增殖培養(yǎng)基為分化培養(yǎng)基，換分化培養(yǎng)基24、72 h后分別收取分化第1天(DM1)和第3天(DM3)的細胞。通過qRT-PCR技術(shù)和Western blot技術(shù)檢測GM期、DM1期和DM3期的干擾效果。

1.4.3 EdU染色法檢測細胞增殖 按Cell-LightEdU Apollo 567 In Vitro Kit說明操作EdU染色試驗，于96孔板中培養(yǎng)細胞，轉(zhuǎn)染24 h后對細胞進行處理，利用熒光顯微鏡檢測陽性細胞數(shù)，每組設(shè)置3個生物學重復(fù)，熒光顯微鏡拍照存圖，每孔至少采集5個不同視野。

1.4.4 熒光定量 PCR 檢測基因表達 24孔板中培養(yǎng)細胞，收取細胞后按照試劑盒說明書提取總RNA，RNA濃度檢測合格后進行反轉(zhuǎn)錄，利用PrimeScript II 1 st Strand cDNA Synthesis Kit進行cDNA第一鏈的合成，稀釋cDNA 5倍后進行qRT-PCR檢測的mRNA表達水平、7、1(增殖標志因子)和、(分化標志因子)的mRNA表達水平。熒光定量PCR體系(總20 μL)：cDNA 2 μL，上、下游引物各 0.5 μL，Mix 10 μL，RNase free water 7 μL。熒光定量PCR 程序：95 ℃預(yù)變性60 s；95 ℃變性10 s；61 ℃退火20 s；72 ℃延伸15 s，40 個循環(huán)；熔解曲線：95 ℃ 10 s；65 ℃ 60 s；97 ℃ 1 s；冷卻：37 ℃ 30 s。qRT-PCR反應(yīng)引物詳情見表1。

表1 qRT-PCR 引物信息Table 1 qRT-PCR primers information

1.4.5 Western blot 檢測蛋白表達 6孔板中培養(yǎng)細胞，待轉(zhuǎn)染處理48、96 h后，加入含1% PMSF的RIPA 裂解液收集蛋白，4 ℃超速離心10 min后取上清液保存于-80 ℃。根據(jù)BCA試劑盒測定蛋白濃度后對蛋白進行變性，根據(jù)蛋白濃度利用Western blot檢測HNRNPAB、Pax7(增殖標志因子)、MyoG、MyHC(分化標志因子)的蛋白表達量。

1.4.6 統(tǒng)計分析 qRT-PCR及Western blot結(jié)果用檢驗分析(SPSS和Image Lab),EDU細胞增殖試驗采用檢驗分析(ImageJ軟件進行細胞計數(shù))，“*”表示差異顯著(<0.05)，“**”表示差異極顯著(<0.01)，“N.S.”表示差異不顯著(>0.05)。

2 結(jié) 果

2.1 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞成肌分化前后 HNRNPAB表達譜分析

為鑒定HNRNPAB是否在成肌分化前后具有關(guān)鍵作用，通過qRT-PCR對進行時間序列表達分析，結(jié)果顯示，隨著牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化時間的延長，的mRNA表達水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在誘導(dǎo)分化第1天的mRNA表達量最高(圖1A)，分化期HNRNPAB的蛋白水平表達量較增殖期(分化前)相比極顯著降低(<0.01)，表明HNRNPAB可能具有調(diào)控牛骨骼肌衛(wèi)星細胞成肌分化的作用(圖1B、C)。

A.HNRNPAB時間序列mRNA表達譜；B.HNRNPAB成肌分化前后蛋白表達水平；C.Western blot量化結(jié)果A.HNRNPAB time-series mRNA expression profile; B.Protein expression levels of HNRNPAB before and after myogenic differentiation; C.Western blot quantification results圖1 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞成肌分化前后HNRNPAB表達量Fig.1 Expression of HNRNPAB in bovine skeletal muscle satellite cells before and after myogenic differentiation

2.2 干擾HNRNPAB表達對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響

構(gòu)建牛骨骼肌衛(wèi)星細胞抑制表達模型，對牛骨骼肌細胞進行轉(zhuǎn)染si-HNRNPAB處理24 h后，EdU細胞增殖試驗檢測細胞的增殖情況，qRT-PCR檢測增殖期細胞中和增殖標志因子7、1的mRNA水平變化，Western blot檢測細胞中HNRNPAB與Pax7蛋白表達水平變化。轉(zhuǎn)染si-HNRNPAB后，HNRNPAB的mRNA水平與蛋白表達水平均極顯著降低(<0.01)，增殖標志因子7和1的mRNA表達水平極顯著降低(<0.01，圖2B)，Pax7的蛋白表達水平極顯著上升(<0.01，圖2C、2D)，EdU陽性細胞率極顯著上升(<0.01,圖2E、2F)。結(jié)果顯示，干擾后降低了牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖標志因子的轉(zhuǎn)錄水平，升高了Pax7的蛋白表達水平。

A.HNRNPAB干擾效果分析；B.增殖標志因子mRNA表達水平；C.增殖期HNRNPAB與Pax7蛋白表達水平；D.Western blot量化結(jié)果；E.EdU染色(200×)；F. EdU標記指數(shù)A. Analysis of the interference effect of HNRNPAB; B. mRNA expression levels of proliferation marker factors; C. Protein expression levels of HNRNPAB and Pax7 in the proliferation phase; D. Western blot quantification results; E. EdU staining (200×); F. EdU labeling index圖2 干擾HNRNPAB對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖的影響Fig.2 The effect of interfering with HNRNPAB on the proliferation of bovine skeletal muscle satellite cells

2.3 干擾HNRNPAB表達對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化的影響

轉(zhuǎn)染si-HNRNPAB處理牛骨骼肌衛(wèi)星細胞48、96 h后，qRT-PCR和Western blot檢測細胞中HNRNPAB以及分化標志因子MyHC、MyoG的mRNA表達水平與蛋白表達水平的變化，顯微鏡觀察細胞成肌分化后的肌管形態(tài)。轉(zhuǎn)染si-HNRNPAB 48及96 h后，的mRNA表達水平極顯著降低(<0.01)，分化標志因子、的mRNA表達水平均極顯著上升(<0.01，圖3A、3B)，轉(zhuǎn)染si-HNRNPAB 96 h后，HNRNPAB的蛋白表達水平極顯著降低(<0.01)，分化標志因子MyoG、MyHC的蛋白表達水平顯著上升(<0.05，圖3C、3D)，倒置顯微鏡下觀察到干擾組與對照組相比，肌管明顯變粗且分化狀態(tài)明顯(圖3E)。結(jié)果顯示，干擾對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化有促進作用。

A.分化第1天HNRNPAB與分化標志因子mRNA表達水平；B.分化第3天HNRNPAB與分化標志因子mRNA表達水平；C.分化第3天HNRNPAB與標志因子蛋白表達水平；D.Western blot量化結(jié)果；E.誘導(dǎo)分化第3天，倒置顯微鏡下細胞生長狀態(tài)(200×)A.The mRNA expression levels of HNRNPAB and differentiation marker factors on the first day of differentiation; B.The mRNA expression levels of HNRNPAB and differentiation marker factors on the third day of differentiation; C.The protein expression levels of HNRNPAB and marker factors on the third day of differentiation; D.Western blot quantification results; E.On the third day of induction of differentiation, the growth state of cells under an inverted microscope (200×)圖3 干擾HNRNPAB對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化的影響Fig.3 Effects of interfering with HNRNPAB on the differentiation of bovine skeletal muscle satellite cells

3 討 論

骨骼肌是哺乳動物機體內(nèi)的重要組成部分，在動物機體的運動、產(chǎn)熱等方面發(fā)揮著不可小覷的作用。骨骼肌衛(wèi)星細胞對骨骼肌的生長、修復(fù)、再生過程都具有調(diào)控作用。當骨骼肌受損后，骨骼肌衛(wèi)星細胞被調(diào)控因子激活，隨后進入增殖、分化進程，最后形成新的肌纖維。骨骼肌的生長發(fā)育不僅包括肌源性調(diào)節(jié)因子，許多轉(zhuǎn)錄因子也參與到調(diào)控進程中。

Pre-mRNA在成為成熟的mRNA的過程中需要多種蛋白質(zhì)的參與，大多蛋白質(zhì)會同RNA形成核糖核蛋白復(fù)合物。其中的核內(nèi)不均一核糖核蛋白復(fù)合物(hnRNP)家族成員約有20多個，除少數(shù)成員外，hnRNPs家族成員都含有RBD(RNA-binding domain)結(jié)構(gòu)域，除了基本的RBD結(jié)構(gòu)域還有其他輔助的結(jié)構(gòu)域(如富含甘氨酸、脯氨酸或酸性的結(jié)構(gòu)域)。有研究表明，hnRNP E1可以下調(diào)HPV16 E6癌基因的表達，從而抑制宮頸癌變。敲除小鼠中hnRNP-U的表達能夠?qū)е绿墙徒饧∪獾倪x擇性萎縮，發(fā)展為肌病。RNA結(jié)合基序蛋白X-連鎖蛋白(RBMX)通過競爭性抑制hnRNP A1介導(dǎo)的PKM可變剪接機制抑制轉(zhuǎn)移性膀胱癌(BCa)的發(fā)展和致瘤性。hnRNP C可以促進新的異質(zhì)核RNA(hnRNAs，也稱為pre-mRNAs)發(fā)展成為成熟mRNAs，并且可以穩(wěn)定mRNAs，控制其翻譯。它與一些癌癥基因和其他生物分子相互作用，其主要功能是調(diào)節(jié)癌基因的穩(wěn)定性和翻譯水平。hnRNP K能夠在轉(zhuǎn)錄水平上抑制肌細胞生成素的表達。綜上研究可知，hnRNP這個蛋白超家族具有廣泛的生物學功能，但大多表現(xiàn)為參與腫瘤的發(fā)生、癌癥的發(fā)展等。

HNRNPAB作為hnRNPs的主要家族成員之一，主要參與調(diào)控mRNA轉(zhuǎn)運、代謝、剪切及表達等過程。近年來，HNRNPAB也被發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，同時，研究發(fā)現(xiàn)HNRNPAB影響了眾多細胞的增殖和分化，但和肌肉發(fā)育相關(guān)的研究還未見報道，所以本研究探索了HNRNPAB在牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化前后的表達量是否存在顯著差異，結(jié)果顯示隨牛骨骼肌衛(wèi)星細胞分化時間的不斷延長，的mRNA表達水平呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在誘導(dǎo)分化第1天表達量最高，蛋白表達水平在分化前后也具有顯著差異。暗示HNRNPAB可能具有調(diào)控牛骨骼肌細胞增殖、分化的作用；隨后通過干擾的表達分析其對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化的影響，結(jié)果顯示，干擾后細胞增殖標志因子7和1的mRNA水平同對照組相比極顯著降低，Pax7的蛋白表達水平極顯著升高，EdU陽性細胞率與對照組相比極顯著上升；干擾后分化標志因子MyoG和MyHC的mRNA水平及蛋白表達水平同對照組相比顯著升高，肌管數(shù)量和肌管直徑明顯大于對照組。由此可知，干擾對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖、分化具有相應(yīng)的影響，抑制HNRNPAB表達后會抑制牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖標志因子的轉(zhuǎn)錄水平，提升Pax7的蛋白表達水平，同時促進牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化。類似的，HNRNPAB對其他細胞的增殖、分化也有著一定的作用，Dang等發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)控miR-M4-5p降低了的表達量后，促進了原代雞胚成纖維細胞的增殖，說明HNRNPAB具有抑制原代雞胚成纖維細胞增殖活性的作用。Taga等發(fā)現(xiàn)，在293T細胞或乳腺癌MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染過表達的載體后，兩種細胞的增殖受到抑制作用，表明HNRNPAB可以抑制細胞增殖進程。這可能是由于HNRNPAB在不同類型的細胞中會發(fā)揮不同的作用，有待進一步驗證。而對于本試驗中干擾后增殖標志因子的mRNA表達水平降低，Pax7的蛋白表達水平卻升高，可能是蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、翻譯效率或蛋白降解所導(dǎo)致，具體原因還需要通過進一步試驗加以驗證。

4 結(jié) 論

本研究利用牛骨骼肌衛(wèi)星細胞體外成肌誘導(dǎo)分化模型，探究hnRNPs家族核心蛋白HNRNPAB對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化的調(diào)控作用，結(jié)果顯示，干擾后抑制牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖標志因子的轉(zhuǎn)錄水平，促進Pax7的蛋白表達水平，并促進了牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的分化。本研究可為進一步深入探索HNRNPAB及其在動物骨骼肌的發(fā)育分化調(diào)控機制等方面提供參考。