代宇星，史銀銀，溫作晨，羅云燕，祝雪麗，鄭春婷，李淑英，洪 亮，張建斌，郭 亮，蒲 蕾

(天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院 天津市農(nóng)業(yè)動物繁育與健康養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384)

全羧化酶合成酶(holocarboxylase synthetase, Hlcs)是動物體內(nèi)多種羧化酶的合成酶，通過催化生物素與體內(nèi)無活性的羧化酶共價連接，使其形成有活性的羧化酶。Hlcs調(diào)控的羧化酶主要有乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC)、丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase, PC)、丙酰輔酶A羧化酶(propionyl-CoA carboxylase, PCC)和甲基巴豆酰輔酶A羧化酶(3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase, MCC)4種。通過Hlcs合成產(chǎn)物酶之一ACC可以催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A，阻止乙酰輔酶A進入三羧酸循環(huán)。細胞糖酵解的產(chǎn)物丙酮酸穿梭進入線粒體，可利用Hlcs合成產(chǎn)物酶之一PC轉(zhuǎn)化為草酰乙酸進入三羧酸循環(huán)產(chǎn)能，并且PC在糖異生過程中也至關(guān)重要。因此Hlcs的產(chǎn)物酶與細胞糖酵解關(guān)系密切。缺失會導致生物素與羧化酶結(jié)合產(chǎn)生障礙，從而造成代謝產(chǎn)物在機體內(nèi)蓄積，使糖代謝出現(xiàn)障礙。

綜上表明，Hlcs與細胞糖酵解有關(guān)，但Hlcs對細胞糖酵解的影響鮮有報道。因此，本研究利用siRNA片段干擾基因，通過檢測在C2C12細胞成肌成脂分化過程中糖酵解相關(guān)基因的表達情況，探明基因?qū)2C12細胞成肌成脂分化后糖酵解的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

C2C12細胞由中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所豬遺傳育種創(chuàng)新團隊提供；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、馬血清、胰島素購于Gibco公司；生物素(維生素B7)、轉(zhuǎn)膜液、電泳液和發(fā)光液購于索萊寶公司；Bodipy493/503染料購于Invitrogen公司；地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、油紅O染料購于Sigma公司；Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量染料均購于TaKaRa公司；Hlcs、Pkm和Gapdh一抗、FITC標記山羊抗兔IgG(H+L)購于碧云天生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液購于上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；siRNA片段合成于吉瑪基因公司。

1.2 試驗技術(shù)及方法

1.2.1 C2C12細胞的培養(yǎng)與siRNA轉(zhuǎn)染 將C2C12細胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞達到70%匯合時，用胰蛋白酶消化細胞3～5 min，加入等量培養(yǎng)基終止消化，以1∶3比例接種細胞。

將對數(shù)期生長的細胞以每孔2.4×10個細胞的密度鋪入6孔板中，待24 h細胞貼壁后，更換為OPTI培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h，利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siRNA。siRNA處理8～12 h后，更換為生長培養(yǎng)基。

1.2.2 C2C12細胞誘導分化及生物素處理 成肌分化：C2C12細胞接觸抑制后1 d，開始誘導分化。用含有2%孕馬血清和100 U·mL青鏈霉素的DMEM誘導液誘導成肌分化，2 d后更換為生長培養(yǎng)基。

成脂分化：C2C12細胞接觸抑制后1 d，開始誘導分化。用孕馬血清成肌誘導液誘導成肌分化2 d后，再用含有0.5 mg·L地塞米松、0.5 mmol·LIBMX、10 μg·mL胰島素的DMEM誘導液誘導成脂分化，最終分化為C2C12脂肪細胞。

生物素處理：前期研究發(fā)現(xiàn)1 μmol·L添加量為最適添加量。在誘導分化過程中，加入1 μmol·L濃度生物素處理細胞，共設(shè)4個處理組：1)對照組(NC)；2)生物素組(biotin)；3)干擾組(siHlcs)；4)生物素與干擾共同處理組(siHlcs+Biotin)。

1.2.3 油紅O染色和Bodipy染色 成脂分化C2C12細胞用PBS清洗2～3次，用4%多聚甲醛固定細胞15 min后，再用PBS清洗3次。

油紅O染色：油紅O染液37 ℃孵育30 min。再用PBS清洗3次。利用倒置顯微鏡觀察染色情況。

Bodipy染色：Bodipy染料避光孵育30 min，再用PBS清洗3次。加入DAPI染料，染核5 min，PBS洗3次。利用倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 免疫熒光染色 C2C12細胞誘導成肌分化4 d后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次。用4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS清洗3次。通透液通透細胞15 min，PBS清洗1次。封閉液封閉1 h，PBS清洗1次。用封閉液按100∶1的比例稀釋一抗Myog，4 ℃孵育過夜或37 ℃孵育2 h。FITC熒光二抗，37 ℃避光孵育1.5 h。DAPI核染5 min，用PBS清洗3次，去除非特異染色，加入抗熒光淬滅劑。熒光顯微鏡下觀察染色后的肌管形態(tài)，并拍照。

1.2.5 實時定量熒光PCR(RT-qPCR) 通過Primer軟件設(shè)計引物，引物序列見表1。以cDNA為模板，進行RT-qPCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系18 μL：2×qPCR Mix 9 μL，模板3 μL，上、下游引物各1 μL，ddHO 4 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。以為內(nèi)參基因，且基因的相對表達量用2方法計算。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting) 將C2C12細胞誘導分化，提取分化6 d的細胞總蛋白。將變性處理后的蛋白在PAGE凝膠上進行點樣，80 V 30 min后轉(zhuǎn)110 V 1.5 h，再將凝膠進行轉(zhuǎn)膜2 h。在室溫下用5%脫脂奶封閉硝酸纖維膜30 min，加入Myog一抗4 ℃孵育過夜，次日TBST清洗3次，每次10 min，再加入FITC二抗孵育2 h，最后用TBST清洗3次，每次10 min。用辣根過氧化物酶對硝酸纖維膜進行曝光，獲得蛋白條帶，并利用ImageJ軟件進行灰度分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS統(tǒng)計數(shù)據(jù)并進行方差分析(one-way ANOVA)。試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標準差”的形式表示。<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 Hlcs基因及糖酵解相關(guān)基因在C2C12細胞成肌分化各個階段的時序表達

用2%馬血清誘導C2C12細胞成肌分化。C2C12細胞成肌分化重要階段的形態(tài)學觀察如圖1所示，圖1A中C2C12細胞為接觸抑制時的細胞形態(tài)，即細胞退出增殖期進入分化期；圖1B為成肌誘導第1天的C2C12細胞，從圖中可以看出此時細胞縱向排列，少量細胞開始融合；圖1C中的C2C12細胞為成肌誘導第8天的細胞形態(tài)，肌管清晰可見且肌管數(shù)量增多。

A. 接觸抑制；B. 誘導成肌第1天；C. 誘導成肌第8天A. Contact inhibition; B. Myogenic day 1; C. Myogenic day 8圖1 C2C12成肌分化細胞形態(tài)Fig.1 C2C12 myoblast differentiation cell morphology

通過實時定量熒光PCR檢測細胞成肌分化第0、2、4、6、8天基因及酵解相關(guān)基因的mRNA表達變化。結(jié)果如圖2所示，、、、-2基因的mRNA表達量先升高、后降低，在分化第4天表達量達到巔峰。、、、-2四者表達量趨勢一致，推測基因與細胞糖酵解具有相關(guān)性。

圖2 C2C12細胞成肌分化各階段Hlcs及糖酵解基因表達譜Fig.2 Expression profiles of Hlcs and glycolytic genes in various stages of myoblastic differentiation of C2C12

2.2 Hlcs基因及糖酵解相關(guān)基因在C2C12細胞成脂分化各個階段的時序表達

用“雞尾酒”誘導C2C12細胞成脂分化。C2C12細胞成脂分化重要階段的形態(tài)學觀察如圖3所示，圖3A為C2C12細胞成脂誘導第1天時的細胞形態(tài)，可以看出此時細胞已經(jīng)匯合；圖3B為成脂誘導第3天的C2C12細胞，此時細胞有小的脂滴形成；圖3C為成脂誘導第8天時C2C12細胞的油紅O染色圖，可見小脂滴不斷聚集形成脂泡。

A. 誘導成脂分化第1天；B. 誘導成脂分化第3天；C. 誘導成脂分化第8天油紅O染色A. Induced adipogenic differentiation on day 1; B. Induced adipogenic differentiation on day 3; C. The Oil red O staining of C2C12 on day 8 of induced adipogenic differentiation圖3 C2C12細胞成脂分化與油紅O染色Fig.3 Adipogenic differentiation of C2C12 cells and Oil red O staining

通過實時定量熒光PCR檢測成脂分化第0、2、4、6、8天基因及糖酵解相關(guān)基因的mRNA表達變化。結(jié)果如圖4所示，、、、-2的mRNA表達量均呈增加趨勢，第2～4天表達量增加較第0～2天快，并在第8天表達量達到巔峰，且、、、-2四者mRNA表達量趨勢一致。

圖4 C2C12細胞成脂分化各階段Hlcs及糖酵解基因表達譜Fig.4 Expression profiles of Hlcs and glycolytic genes in various stages of lipogenic differentiation of C2C12 cell

2.3 siHlcs在成肌分化的C2C12細胞中對糖酵解基因表達的影響

用siRNA干擾片段降低基因的表達，用2%馬血清誘導成肌分化，在熒光倒置顯微鏡下觀察C2C12細胞成肌分化情況，結(jié)果如圖5所示，與NC組相比，生物素和siHlcs處理C2C12細胞后，其肌管數(shù)量明顯變少，且肌管融合指數(shù)顯著低于NC組(<0.05)。

A. Myog 免疫熒光染色；B.融合指數(shù)(融合指數(shù)為多核肌管核數(shù)(大于等于兩個細胞核)與總細胞核數(shù)的比例)A. Myog immunofluorescence staining; B. Fusion index (The fusion index is the ratio of the number of multinucleated myotubular nuclei (greater than or equal to two nuclei) to the total number of nuclei)圖5 C2C12細胞成肌分化免疫熒光染色Fig.5 Myogenic differentiation of C2C12 cells by immunofluorescence staining

RT-qPCR檢測mRNA結(jié)果如圖6所示。由圖6A可知，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組、siHlcs和生物素共同處理組均顯著降低了的mRNA表達量(<0.05)；圖6B顯示，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組、siHlcs和生物素共同處理組均顯著升高了的mRNA表達量(<0.05)；由圖6C可知，與NC組相比，添加生物素組顯著升高了-2的表達量(<0.05)，而siHlcs組、siHlcs和生物素共同處理組均顯著降低了-2的mRNA表達量(<0.05)；由圖6D可知，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組、siHlcs和生物素共同處理組均顯著降低了的mRNA表達量(<0.05)。此外，Western blotting結(jié)果顯示(圖6E-G)，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組、siHlcs和生物素共同處理組均顯著降低了Hlcs的蛋白豐度(<0.05)；與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組、siHlcs和生物素共同處理組均顯著升高了Pkm的蛋白豐度(<0.05)。

A. Hlcs mRNA相對表達量；B. Pkm mRNA相對表達量；C. Hk-2 mRNA相對表達量；D. Pfkm mRNA相對表達量；E. Hlcs、Pkm蛋白的免疫印跡；F. Hlcs蛋白的免疫印跡定量分析；G. Pkm蛋白的免疫印跡定量分析。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同A. Relative mRNA expression of Hlcs; B. Relative mRNA expression of Pkm; C. Relative mRNA expression of Hk-2; D. Relative mRNA expression of Pfkm; E. Protein immunoblotting of Hlcs and Pkm; F. Quantitative analysis of Western blotting of Hlcs; G. Quantitative analysis of Western blotting of Pkm. Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05), the same as below圖6 Hlcs基因干擾對C2C12成肌分化過程中酵解基因表達的影響Fig.6 Effects of Hlcs gene interference on the expression of glycolysis genes during myoblast differentiation of C2C12

2.4 siHlcs在成脂分化的C2C12細胞中對糖酵解基因的影響

用siRNA干擾的表達，用Bodipy染色檢測siHlcs對C2C12細胞成脂分化的影響，結(jié)果如圖7所示，與NC組相比，添加生物素組脂滴形成減少，siHlcs組脂滴形成減少，而siHlcs與生物素共同處理則可緩解siHlcs的抑制作用。

A. 脂滴Bodipy染色；B. Bodipy熒光強度量化圖A．Lipid droplet Bodipy staining；B. Bodipy fluorescence intensity quantification diagram圖7 C2C12細胞成脂分化Bodipy染色Fig.7 Adipogenic differentiation of C2C12 cells by Bodipy staining

RT-qPCR檢測mRNA表達量結(jié)果如圖8所示。由圖8A可知，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組、siHlcs與生物素共同處理組均顯著降低了的mRNA表達量。圖8B顯示，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組、siHlcs與生物素共同處理組均顯著升高了的mRNA表達量。圖8C中，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組顯著降低了-2的mRNA表達量，而siHlcs與生物素共同處理組無顯著差異(>0.05)。Western blotting結(jié)果顯示，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組和siHlcs與生物素共同處理組均顯著降低了Hlcs的蛋白表達量(圖8F)，而添加生物素組和siHlcs組均能上調(diào)Pkm的蛋白表達量，siHlcs與生物素共同處理組與NC組相比無顯著差異(圖8G)。

A. Hlcs mRNA相對表達量；B. Pkm mRNA相對表達量；C. Hk-2 mRNA相對表達量；D. Pfkm mRNA相對表達量；E. Hlcs、Pkm蛋白的免疫印跡；F. Hlcs蛋白的免疫印跡定量分析；G. Pkm蛋白的免疫印跡定量分析A. Relative mRNA expression of Hlcs; B. Relative mRNA expression of Pkm; C. Relative mRNA expression of Hk-2; D. Relative mRNA expression of Pfkm; E. Protein immunoblotting of Hlcs and Pkm; F. Quantitative analysis of Western blotting of Hlcs; G. Quantitative analysis of Western blotting of Pkm圖8 Hlcs基因干擾對C2C12成脂分化過程中酵解基因表達的影響Fig.8 Effects of Hlcs gene interference on the expression of glycolysis genes during adipogenic differentiation of C2C12

3 討 論

細胞中葡萄糖的利用分為兩部分，一部分是糖酵解，另一部分是通過糖酵解終產(chǎn)物進入三羧酸循環(huán)產(chǎn)能。細胞糖酵解是利用己糖激酶(hexokinase 2，Hk-2)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，Pfkm)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase，Pkm)等將葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楸岬倪^程。本研究發(fā)現(xiàn)，C2C12細胞成肌分化過程中、、和-2基因呈先升高，第4天時表達量最高，之后降低的表達趨勢。這可能是因為細胞在成肌分化中期，細胞融合形成肌管，需要大量能量。本研究發(fā)現(xiàn)，在C2C12成肌分化后期表達量下降，與孫慧

研究在衰老間充質(zhì)干細胞中表達量下降的結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著C2C12細胞成脂分化的進行，基因的表達量逐漸升高，且在C2C12細胞成脂分化的后期、和-2基因表達量升高，可能與肌內(nèi)脂肪細胞主要通過周圍肌肉細胞提供的葡萄糖為來源合成脂肪，隨著分化的進行，細胞需要產(chǎn)生更多的脂肪，糖酵解速率加快，產(chǎn)生更多的中間產(chǎn)物(如乙酰輔酶A)轉(zhuǎn)化為脂肪。所以C2C12細胞隨著成脂分化的進行糖酵解基因表達量逐漸增加。

基于前期研究發(fā)現(xiàn)，基因與C2C12細胞不同分化狀態(tài)下糖酵解相關(guān)基因的表達趨勢相同，且基因的下游羧化酶與糖酵解功能密切相關(guān)，故進行后續(xù)干擾相關(guān)研究。細胞糖酵解過程只產(chǎn)生少量的ATP，但糖酵解中間產(chǎn)物可作為原料合成氨基酸。C2C12細胞成肌分化過程中對照組細胞糖酵解基因表達高，酵解活動旺盛，中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為氨基酸。干擾基因后，與對照組相比，和-2表達量顯著降低。Hlcs作為全羧化酶合成酶，其表達量降低，PC的合成受阻，從而限制丙酮酸在線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，導致草酰乙酸減少，三羧酸循環(huán)無法順利進行。草酰乙酸和三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物合成障礙，無法順利合成相應(yīng)氨基酸，導致相關(guān)產(chǎn)物在細胞內(nèi)蓄積，抑制和-2表達。且有研究證明，基因敲除的豬腎上皮細胞的糖酵解效率降低，造成糖酵解中間產(chǎn)物的積累，影響到線粒體活性，抑制細胞ATP的產(chǎn)生。細胞成肌分化過程中，肌肉糖代謝中間產(chǎn)物如丙酮酸和草酰乙酸等合成非必須氨基酸。C2C12細胞成肌分化過程中干擾基因后基因的表達增加，可能是因為缺失，導致PC缺失，丙酮酸無法轉(zhuǎn)化成草酰乙酸，無法生成相應(yīng)氨基酸，導致Pkm的表達代償性增加。也有可能缺失減少了PC合成，導致草酰乙酸增補減少，進而使磷酸烯醇式丙酮酸合成減少。加之糖酵解上游的和-2表達降低，同時導致磷酸烯醇式丙酮酸的合成降低，是否代償性導致Pkm表達增加尚不明確。生物素是多種羧化酶的輔助因子，可催化葡萄糖生成和氨基酸分解的關(guān)鍵反應(yīng)。缺乏生物素會導致葡萄糖的利用率降低，從而阻礙糖酵解反應(yīng)的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，在成肌分化C2C12細胞中，添加生物素會上調(diào)Pkm、-2的表達，可能是由于添加生物素后，促進細胞內(nèi)AMPK活性，從而促進葡萄糖吸收而抑制糖異生，加速糖酵解進程。

與成肌細胞不同，成脂細胞內(nèi)的大量能量向合成脂肪酸的途徑流轉(zhuǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，在C2C12細胞成脂分化中，干擾基因后Pkm表達量同樣增高。除了磷酸烯醇式丙酮酸減少導致Pkm代償性增加的原因外，還有可能是因為表達量降低后，ACC缺失，乙酰輔酶A在ACC的催化下轉(zhuǎn)化為丙二酰單酰輔酶A受阻，無法起始脂肪酸合成途徑，導致脂肪酸含量降低，從而促進Pkm的活性。有報道稱，高濃度長鏈脂肪酸會抑制Pkm的活性。加之高強度的成脂誘導分化，細胞內(nèi)需要大量的乙酰輔酶A合成脂肪，但是又由于缺乏ACC無法順利合成，所以代償性的增加Pkm，促進丙酮酸的生成，進而促進乙酰輔酶A的產(chǎn)生。脂肪酸合成途徑中，三羧酸轉(zhuǎn)運體系使用檸檬酸作為乙?；妮d體，將線粒體產(chǎn)生的乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移到細胞溶膠中參與脂肪酸合成。本研究發(fā)現(xiàn)，在成脂分化的C2C12細胞中，干擾基因后表達量升高。可能是因為干擾使ACC和PC合成受阻，導致三羧酸轉(zhuǎn)運體系中草酰乙酸的合成減少，丙酮酸產(chǎn)生更多的乙酰輔酶A，乙酰輔酶A無法合成脂肪，也由于缺乏草酰乙酸，乙酰輔酶A無法和草酰乙酸順利合成檸檬酸。所以與對照組相比，低濃度檸檬酸促進Pfkm的表達。與對照組相比，在成脂過程中，干擾組ACC和PC缺乏，導致三羧酸循環(huán)受限，脂肪生成受阻，導致ADP在體內(nèi)蓄積，ADP為Pfkm的促進劑，促進6-磷酸果糖利用Pfkm合成1,6-二磷酸果糖。上述過程均與脂肪生成有關(guān)，而-2基因是細胞糖酵解的初始階段，單獨受6磷酸葡萄糖含量的調(diào)控。成脂過程中，基因缺乏導致-2基因表達下調(diào)的原因尚待進一步研究。

4 結(jié) 論

在C2C12細胞成肌和成脂分化過程中，糖酵解相關(guān)基因-2、、mRNA的表達與基因表達趨勢一致；干擾基因可以抑制成肌分化C2C12細胞和-2基因的表達，促進Pkm的表達；而促進成脂分化C2C12細胞和Pkm的表達，抑制-2基因的表達；添加生物素能夠促進C2C12細胞成肌成脂分化后酵解相關(guān)基因的表達。證明基因和生物素在C2C12細胞酵解過程中有重要調(diào)控作用。