鄭曉楠，李婷婷，王金磊，鄭文斌，朱興全, 4*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，太谷 030801； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，蘭州 730046； 3.溫州醫(yī)科大學檢驗醫(yī)學院、生命科學學院，檢驗醫(yī)學教育部重點實驗室、溫州市環(huán)境衛(wèi)生微生物檢驗重點實驗室，溫州 325035；4.云南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，昆明 650201)

剛地弓形蟲()簡稱弓形蟲，它可感染幾乎所有的溫血動物，引起危害嚴重的人獸共患弓形蟲病。全世界約1/3的人慢性感染弓形蟲，感染途徑主要是攝入被弓形蟲卵囊污染的食品或含有弓形蟲包囊的肉類。不同個體感染弓形蟲的癥狀不同，免疫功能正常的人群感染弓形蟲表現(xiàn)為無癥狀；但免疫缺陷患者(例如器官移植患者、癌癥患者和HIV感染患者等)感染弓形蟲可導致弓形蟲腦炎、脈絡膜視網(wǎng)膜炎、甚至死亡；孕婦感染弓形蟲可能導致流產(chǎn)、畸胎、甚至死胎。弓形蟲除引起人類疾病外，還可能導致家畜流產(chǎn)和死胎，尤其是豬、綿羊和山羊。因此，弓形蟲是一種威脅畜牧業(yè)發(fā)展和人類健康的重要人獸共患寄生蟲。

治療弓形蟲病最有效的方案是組合使用乙胺嘧啶-磺胺嘧啶。但這種治療方案仍有多種劣勢，包括僅對弓形蟲快速分裂的速殖子有效，但對包囊中相對緩慢分裂的緩殖子沒有顯著的治療效果；不能治愈持續(xù)感染；治療后的宿主可能出現(xiàn)多種副作用。針對弓形蟲病的疫苗有助于預防弓形蟲病，也可減少宿主對化學療法的依賴和化學療法造成的副作用。但目前只有一種商業(yè)可用的弓形蟲疫苗(Toxovax)被許可用于防止綿羊流產(chǎn)，且這種減毒活疫苗并不適用于預防人弓形蟲病。

致密顆粒蛋白(dense granule proteins，GRAs)是由弓形蟲的致密顆粒分泌的一類蛋白質，具有重要的生物學功能。有些致密顆粒蛋白通過調控宿主細胞的基因表達、信號通路進而調控宿主的免疫反應，是弓形蟲重要的毒力因子，也是潛在的疫苗候選分子；有些致密顆粒蛋白參與弓形蟲營養(yǎng)物質的攝取、蛋白質的轉運與定位等重要的生理過程，以期成為治療弓形蟲病的潛在藥物靶點。因此，作者對弓形蟲致密顆粒蛋白生物學功能的最新研究進展進行綜述，旨在為弓形蟲的致病機制、藥物靶點、疫苗等相關研究提供新思路。

1 致密顆粒蛋白的概述

致密顆粒(dense granule，DG)是弓形蟲的一個亞細胞分泌器官，于20世紀60年代被發(fā)現(xiàn)，其在電子顯微鏡下的形態(tài)類似于聚集的球狀顆粒，大小約為200 nm；致密顆粒分泌的蛋白被統(tǒng)一命名為致密顆粒蛋白。致密顆粒蛋白中的氨基酸主要為脯氨酸，但不同的致密顆粒蛋白的氨基酸組成、含量、結構域均不同，因此其發(fā)揮的生理學功能也有很大差異。在不同的生長周期，弓形蟲分泌的致密顆粒蛋白種類和數(shù)量不同。速殖子在入侵宿主細胞后會分泌致密顆粒蛋白，這些致密顆粒蛋白往往溶于納蟲空泡(parasitophorous vacuole，PV)管腔、結合于納蟲泡膜(PV membrane，PVM)、定位于PV內膜結構的微管網(wǎng)狀結構(intravacuolar network，IVN)或被分泌到宿主細胞細胞質或轉運至宿主細胞核中，參與調控宿主細胞免疫、調節(jié)宿主細胞周期、蛋白轉運、營養(yǎng)吸收等多種重要的生理過程。

2 致密顆粒蛋白的生物學功能

目前，已報道近70種致密顆粒蛋白，主要包括典型的GRA類致密顆粒蛋白(GRAs)、STAT轉錄抑制劑(inhibitor of STAT transcription，TgIST)、線粒體結合因子(mitochondrial association factor，MAF)、c-Myc調節(jié)因子(c-Myc regulation，MYR)等，其分泌后的定位主要包括PVM、IVN、PV、宿主細胞核、宿主細胞質等。

2.1 調節(jié)宿主細胞的免疫反應

弓形蟲速殖子入侵宿主細胞后，致密顆粒蛋白可改變宿主細胞的免疫狀態(tài)和細胞內環(huán)境，以實現(xiàn)免疫逃避和長期寄生。這類致密顆粒蛋白包括主要定位于PVM及PV的GRA6、GRA7、GRA15、GRA60、MAF1，主要定位于PV的GRA25，以及分泌后轉運至宿主細胞核的GRA24、TgIST、TEEGR/HCE和宿主細胞質的GRA18、MAG1(matrix antigen 1)，其調節(jié)宿主免疫反應的途徑包括操控宿主的免疫信號通路和(或)宿主免疫相關基因的表達、抵抗免疫相關GTP酶(immunity related GTPases,IRG)介導的防御體系(表1)。

表1 參與調節(jié)宿主細胞免疫反應的致密顆粒蛋白Table 1 Dense granule proteins involved in regulating immune response of host cells

2.1.1 操控宿主的免疫信號通路和(或)免疫相關的基因表達 弓形蟲入侵宿主細胞后，會在宿主細胞質內形成一個由PVM包裹的PV，并在PV中繁殖。定位于PVM的GRA6、GRA15、MAF1可調控宿主免疫相關的信號通路和基因表達，進而控調細胞因子的表達。GRA6通過鈣調節(jié)配體(calcium modulating ligand，CAMLG)激活T細胞核因子4(nuclear factor of activated T cells 4，NFAT4)，進而操控宿主細胞產(chǎn)生免疫應答，例如刺激趨化因子CXCL2(C-X-C motif chemokine ligand-2)和CCL2(C-C motif chemokine ligand-2)的產(chǎn)生，將炎性單核細胞和中性粒細胞吸引到感染部位，進而抑制弓形蟲的擴散。GRA15是一種蟲株特異性效應物，在Ⅱ型弓形蟲Pru蟲株中介導NF-κB(nuclear factor kappa B)的核易位和調控NF-κB介導的宿主細胞轉錄，促進白細胞介素12(interleukin-12，IL-12)的表達；GRA15還可通過核苷酸結合寡聚結構域(nucleotide binding oligomeric domain，NOD)樣模式識別受體3(NOD-like receptor 3，NLRP3)刺激炎癥小體的形成，并誘導IL-1β的分泌。另外，定位于PVM的弓形蟲線粒體結合因子1(MAF1)在弓形蟲感染期間調節(jié)先天免疫反應中起著關鍵作用。研究表明，MAF1可參與弓形蟲對宿主線粒體的招募(host mitochondrial association，HMA)，改變宿主細胞免疫基因的轉錄和感染小鼠體內細胞因子的表達，例如增強IL-6、IL-10和CCL5的表達，進而調控弓形蟲的生長。

GRA24、TgIST、TEEGR/HCE(E2F4-associated EIH2-inducing gene regulator)分泌后最終易位到細胞核，影響宿主的基因表達和(或)信號轉導。GRA24被分泌后易位至宿主細胞質，與p38α絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)結合并激活轉運至宿主細胞核，通過激活促炎性細胞因子，尤其是CCL2、單核細胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)和IL-12的產(chǎn)生，引發(fā)強烈的炎癥反應，從而增強感染部位的吞噬細胞的吞噬活性，限制弓形蟲的生長繁殖。STAT轉錄抑制劑(TgIST)分泌后跨過PVM并聚集在宿主細胞核發(fā)揮功能，例如將Mi-2/NuRD(Mi-2/nucleosome remodeling and deacetylase)復合物募集到STAT1依賴性啟動子上，從而導致宿主細胞核內的染色質改變和轉錄受阻；通過阻斷STAT1信號傳導，抑制宿主細胞對Ⅱ型干擾素IFN-γ的免疫反應，對控制感染至關重要；通過抑制宿主細胞中STAT1/STAT2介導的轉錄來阻斷Ⅰ型干擾素IFN-β反應；在感染早期，通過阻斷免疫血清球蛋白(immune serum globulin,ISG)介導的有效寄生蟲殺滅作用，保護原始細胞內第一波入侵的速殖子。弓形蟲E2F4相關的EZH2誘導基因調控因子(TEEGR/HCE)分泌后被最終轉運至細胞核，可結合宿主轉錄因子E2F3和E2F4并誘導基因表達，同時通過開啟EZH2以促進非宿主細胞容許的染色質的形成，進而抑制宿主NF-κB信號的轉導并調節(jié)宿主細胞周期，促進弓形蟲在宿主細胞內的復制。GRA28也是分泌后最終轉運至宿主細胞核的一種致密顆粒蛋白，但其生物學功能仍需進一步研究。

GRA18和MAG1跨越PVM后，可最終易位到宿主細胞質，調控宿主細胞的免疫反應。GRA18穿過PVM后在宿主細胞的細胞質中選擇性地調控宿主細胞免疫基因的表達。在巨噬細胞感染的情況下，GRA18可誘導趨化因子CCL17和CCL22的表達以及抗炎反應相關的特定基因的表達。MAG1除分布在速殖子的PV基質、包囊的囊壁和基質外，在速殖子和緩殖子階段均會分泌到宿主細胞質內；MAG1是弓形蟲的毒力因子和炎癥調節(jié)分子，在宿主細胞質內可刺激IL-1β的分泌進而抑制炎癥小體的激活，有利于弓形蟲的存活和慢性感染的建立。定位于PV的GRA25則可降低被感染巨噬細胞的CCL2和CXCL1的表達，是Ⅱ型弓形蟲的毒力因子和免疫調節(jié)劑。

弓形蟲感染宿主后，宿主會識別弓形蟲并激活自身的固有免疫、誘導產(chǎn)生獲得性免疫，進而控制弓形蟲在宿主的大量繁殖；而弓形蟲也會分泌一些效應蛋白到宿主中，通過調控宿主的基因表達或信號通路轉導，逃避宿主的免疫反應、避免宿主過早識別并清除弓形蟲和被感染的宿主細胞。除以上GRA6、GRA15、GRA24、TgIST等致密顆粒蛋白外，弓形蟲還可能分泌其他未知的效應蛋白至宿主細胞，也可能調控未知基因的表達或信號通路的轉導，進而維持兩者之間的免疫平衡。激活宿主免疫反應的效應蛋白可用于構建亞單位疫苗，抑制宿主免疫反應的蛋白可用于構建基因缺失弱毒疫苗。因此，進一步高通量篩選并鑒別新的分泌到宿主細胞的致密顆粒蛋白或其他效應蛋白、發(fā)現(xiàn)新的宿主與弓形蟲互作并影響兩者免疫平衡的基因或信號通路，對揭示宿主與弓形蟲之間的免疫互作機制及闡明弓形蟲的致病機制均意義重大。

2.1.2 抵抗IRG防御體系 除以上致密顆粒蛋白可通過調控宿主細胞信號通路和(或)基因表達進而調節(jié)宿主細胞的免疫反應外，定位于PVM的部分致密顆粒蛋白可抑制通過IFN-γ誘導產(chǎn)生的IRG，避免宿主細胞對PV的破壞，進而改變宿主免疫反應(表1)。GRA7、GRA60也可抵抗宿主細胞的IRG防御系統(tǒng)，增強弓形蟲的毒力。在入侵宿主細胞時，GRA7被磷酸化并與棒狀體蛋白ROP18相互作用后，使調節(jié)免疫相關GTP酶6(IRGA6)特異性失活，從而抵抗IFN-γ激活的宿主先天免疫。GRA60可抑制宿主細胞IRGA10和IRGA6被招募到PVM上，以促進弓形蟲在宿主細胞中的復制，是Ⅰ型弓形蟲RH蟲株抵抗IRG的重要毒力因子。除此之外，定位于IVN的GRA12可抵抗宿主細胞IFN-γ介導的免疫反應，是弓形蟲重要的毒力因子，但其與IRG6在PVM的招募無關。研究表明，在小鼠體內，IFN-γ可控制弓形蟲的生長主要是由于其可誘導IRGs和鳥苷酸結合蛋白(guanylate binding proteins，GBPs)的產(chǎn)生，大量的IRGs和GBPs結合到PVM后，最終導致弓形蟲死亡。GRA12雖與IRG6在PVM的聚集無關，但其可能與其他IRGs或GBPs有關。因此，進一步挖掘弓形蟲中能抑制IRGs或GBPs的致密顆粒蛋白，將有助于發(fā)現(xiàn)其他毒力因子。

2.2 調節(jié)宿主細胞周期

GRA16和TEEGR/HCE可通過改變宿主細胞中的信號轉導而調整宿主細胞的細胞周期，降低弓形蟲在宿主細胞中的繁殖速度(表2)。GRA16分泌后穿越PVM，在宿主細胞質與B55蛋白磷酸酶調控亞基2A(protein phosphatase 2A regulatory subunits B55，PP2A-B55)和皰疹病毒相關泛素特異性蛋白酶(herpes virus-associated ubiquitin-specific protease，HAUSP)結合后核易位，進而干擾腫瘤抑制因子P53的穩(wěn)定性和活性，延長宿主細胞周期中的G2期。TEEGR/HCE可與特定的轉錄因子E2F3、E2F4、DP1結合，可調控宿主細胞內編碼細胞周期蛋白E的基因表達，從而促使感染細胞較快速地通過G1/S轉換期，并進入G2期，以利于弓形蟲的生長。另外，與GRA16轉運相關的致密顆粒蛋白MYR1～4和GRA44可通過介導GRA16的易位，進而致使宿主細胞c-Myc和細胞周期調節(jié)蛋白E1上調(表2)。但目前尚不清楚宿主細胞停滯在G2期會有益于弓形蟲生長的機制，需要進一步探究。

表2 參與調節(jié)宿主細胞周期的致密顆粒蛋白Table 2 Dense granule proteins involved in regulating host cell cycle

2.3 參與蛋白的轉運與定位

致密顆粒蛋白分泌后需轉運至PVM或宿主細胞質或宿主細胞核，以發(fā)揮其功能，如參與蟲體生長、調控蟲體的毒力及包囊形成、維持PV和PVM的穩(wěn)定性以及調控蟲體的營養(yǎng)攝取和宿主信號通路的轉導等。目前發(fā)現(xiàn)，參與致密顆粒蛋白轉運和定位的有MYR(1～4)、TgPPM3C(protein phosphatases Mg21/Mn21 dependent 3C)、GRA42、GRA43、GRA44和GRA45等(表3)。

表3 參與蛋白轉運和定位的致密顆粒蛋白Table 3 Dense granule proteins involved in protein transport and localization

部分致密顆粒蛋白主要定位于PVM，其在弓形蟲分泌的效應蛋白的轉運過程中發(fā)揮重要作用，特別是MYRs、TgPPM3C。MYR是弓形蟲的一類分泌蛋白，因其可調控宿主細胞中c-Myc的表達而命名，目前發(fā)現(xiàn)的MYR主要包括MYR1、MYR2、MYR3和MYR4；MYR2和MYR3分泌后在PVM上與MYR1共定位，且MYR3與MYR1穩(wěn)定地結合在PVM上，這類MYR均參與弓形蟲分泌蛋白的易位。研究表明，弓形蟲感染宿主細胞后，大多數(shù)對弓形蟲感染應答的差異性基因均依賴于MYR1；MYR1可與GRA44、GRA45、TgPPM3C相互作用，將弓形蟲分泌的效應子易位到宿主細胞后，影響宿主細胞的代謝和基因表達等；MYR1還可與GRA44、GRA45、MYR4互作，共同介導GRA16的易位以及宿主細胞c-Myc和細胞周期調節(jié)蛋白E1的上調。TgPPM3C是含有絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶結構域的致密顆粒蛋白，可與MYR1互作，參與GRA18、GRA28、MYR1的磷酸化，并可介導這類分泌蛋白到宿主細胞的轉運過程。

主要定位于PV的GRA42、GRA43、GRA44和GRA45也參與分泌蛋白的轉運和定位。GRA42和GRA43介導了包括GRA17、GRA23、GRA35在內的多種致密顆粒蛋白在PVM的正確定位。GRA44與GRA45以及弓形蟲高爾基體天冬氨酰蛋白酶(aspartyl protease V，ASP5)、MYR1、MYR2、MYR3、PPM3C、棒狀體蛋白17(ROP17)共同形成的PVM轉運系統(tǒng)，將GRA蛋白由PV轉運到宿主細胞核。GRA44和GRA45作為ASP的底物，主要參與GRA16和GRA24至宿主細胞核的轉運；GRA44還與MYR1/2/3復合物互作，激活宿主致癌因子c-Myc。伴侶蛋白GRA45可以通過維持其在分泌途徑中的天然折疊狀態(tài)將PVM定位的GRAs正確轉運和定位，例如GRA5、GRA7、MAF1、GRA23和GRA44的定位與轉運。另外，GRA45還是弓形蟲的毒力因子，敲除后弓形蟲的生長和毒力均下降。

ASP5在弓形蟲致密顆粒轉運系統(tǒng)中發(fā)揮至關重要的作用。研究表明，ASP5可識別轉運原件(export element，TEXEL)，即RRL位點。含有RRL位點的致密顆粒蛋白會在高爾基體中被ASP5切割，切割后被轉運至PVM，例如MYR1、GRA16、GRA19、GRA20和GRA44。而部分不含有RRL位點的致密顆粒蛋白的定位也會因ASP5缺失而受到影響，例如GRA2、GRA3、GRA7、GRA35、GRA24、MYR2、MYR3和TEEGR/HCE1，這可能是因為ASP5操控了其他參與轉運這類蛋白的轉運子。分子伴侶GRA42、GRA43、GRA45參與GRA17、GRA23、GRA35等在PVM上的定位，GRA45還影響定位在宿主細胞核的致密顆粒蛋白的轉運。但GRA45含有RRL位點，GRA42和GRA43不含有RRL位點，說明可能存在其他含有RRL位點的調控蛋白影響GRA42和GRA43的功能。這啟示著需要進一步挖掘參與GRAs轉運的致密顆粒蛋白，完善對弓形蟲致密顆粒蛋白轉運機制的認識。

2.4 參與營養(yǎng)物質的攝取

弓形蟲需要從宿主細胞中攝取自身生長發(fā)育所需的營養(yǎng)素。PVM作為弓形蟲與宿主細胞質的物理屏障界面，可介導營養(yǎng)物質的攝取和運輸、并最終將營養(yǎng)物質轉運至PV內供弓形蟲生長所用。多種定位于PVM的GRAs在維持PVM滲透性以及攝取營養(yǎng)物質的過程中發(fā)揮重要作用，例如GRA2、GRA3、GRA6、GRA7、GRA14、GRA17、GRA23(表4)。

表4 參與營養(yǎng)物質攝取的致密顆粒蛋白Table 4 Dense granule proteins involved in nutrient uptake

2.4.1 參與PVM中微孔的形成，維持PV的正常形態(tài)和PVM的滲透性 PVM是一種選擇性滲透膜，允許高達1.3 ku的分子物質在不依賴電荷的情況下進行自由擴散。GRA17和GRA23定位于弓形蟲的致密顆粒、PVM和IVN中，參與PVM中微孔的組成，可介導宿主細胞質和PV內小分子物質的運輸，對維持PVM的滲透性起著重要作用。研究表明，弓形蟲缺失GRA17后，PV出現(xiàn)體積增大的異常形態(tài)，PVM減弱了對小分子的滲透性，但在GRA17的缺失株回補高表達的GRA23后，可部分恢復PV的形態(tài)以及PVM對小分子的滲透性。這說明GRA17與GRA23協(xié)同參與弓形蟲PVM的滲透性，其對弓形蟲營養(yǎng)物質的攝入以及有毒有害產(chǎn)物的排出至關重要。另外，GRA17在慢性感染階段定位于包囊膜，對包囊的正常形態(tài)和包囊膜通透性的維持以及物質的轉運也至關重要。GRA17和GRA23也是弓形蟲重要的毒力因子，Ⅰ型和Ⅱ型的基因敲除蟲株均可在小鼠急性、慢性和先天性感染中構建免疫保護作用。由此可知，PVM中微孔對維持PV內的滲透壓、從宿主細胞質攝取營養(yǎng)物質以及排除有毒的代謝產(chǎn)物等過程至關重要。進一步探索PVM中微孔的組成成分，將有助于揭示小分子在弓形蟲與宿主細胞之間的滲透機制。

2.4.2 參與IVN的形成或維持IVN的穩(wěn)定 弓形蟲侵入宿主細胞后，會在宿主細胞內形成的PV中復制。PV內具有一個與PVM連接的納米管網(wǎng)絡(IVN)，其由直徑為20～50 nm的膜小管組成，貫穿整個空泡空間。IVN增加了弓形蟲與宿主之間物質交換的表面積，有利于效應蛋白和營養(yǎng)物質的吸收，進而促進弓形蟲的生長。IVN在弓形蟲入侵后幾分鐘內形成，但其具體的形成機制仍然未知。目前，多種定位于IVN的GRAs相繼被發(fā)現(xiàn)，例如GRA1、GRA2、GRA4、GRA6、GRA9、GRA12、GRA41、WNG1等。其中，GRA2、GRA6、GRA41和WNG1參與IVN形成；GRA6和WNG1維持IVN的穩(wěn)定。

IVN的生物發(fā)生需要GRA2和GRA6。GRA2的兩個完整的兩親性α-螺旋是IVN正確形成所必需的；GRA2缺失會導致PV內結構明顯紊亂，對宿主細胞溶質蛋白、Rab小泡和脂滴的攝取顯著減少。GRA6缺失后INV的初始結構正常，但IVN的成熟結構發(fā)生突變。另外，GRA2和GRA6也是弓形蟲的毒力因子。GRA41是一種與IVN相關的致密顆粒蛋白，其缺失后組成IVN的小管變短且數(shù)量減少，形成小管的小泡數(shù)量增多，致使INV形態(tài)出現(xiàn)異常。但GRA2、GRA6、GRA41轉運至IVN的機制仍然未知。GRA12也是PV內與IVN相關的蛋白，可抵抗宿主IFN-γ介導的免疫反應，進而調控宿主免疫應答，是Ⅰ型和Ⅱ型弓形蟲的毒力因子，在急性和慢性感染中均發(fā)揮了重要作用。除以上致密顆粒蛋白外，定位于PV內的WNG1激酶也是一種參與IVN的形成與穩(wěn)定的致密顆粒蛋白，這是由于包括GRA4、GRA6在內的多種與IVN形成有關的GRA類蛋白均需要被WNG1磷酸化后才可發(fā)揮功能。除GRA4、GRA6外，仍可能存在其他具有磷酸化位點的GRAs被WNGI磷酸化，進而影響IVN的形成。而IVN作為PVM的延伸，可有效地增強弓形蟲對營養(yǎng)物質的吸收效率。由此推測，影響IVN形成的因子可能會限制弓形蟲的生長。因此，深入研究IVN的形成過程、參與IVN形成的GRAs的轉運方式、WNG1的其他磷酸化底物等，將有助于深入揭示IVN的形成機制和生物學功能，發(fā)現(xiàn)弓形蟲的潛在藥物靶點。

2.4.3 參與脂質營養(yǎng)的攝取 弓形蟲會從宿主細胞中攝取多種脂質物質，例如鞘磷脂、膽固醇等。定位于PVM的部分GRA本身是跨膜蛋白或與跨膜蛋白互作，形成特定的脂質攝取結構，進而影響弓形蟲對宿主細胞中脂質的攝取。GRA3是一種定位于PVM和包囊囊壁的Ⅰ型跨膜蛋白，是GRA7的組成鏈；GRA3可與內質網(wǎng)的Ⅱ型跨膜蛋白CAMLG相互作用，特異性地結合脂質，促進PVM的結構修飾，進而招募宿主高爾基體并將其吞噬到PV中，攝取宿主細胞內的鞘磷脂。GRA7可與宿主的微管相互結合形成納蟲泡胞內膜-宿主微管橋(host organelle-sequestering tubulo-structures，HOST)結構，幫助蟲體攝取宿主溶酶體中的膽固醇；GRA7還使脂質體變形成管狀膜，并與GRA2、GRA6聯(lián)合限制了PV內的IVN擴展。截至目前，HOST結構的組成部分、HOST結構攝取宿主細胞中營養(yǎng)物質的種類、脂質物質攝取后的轉運及應用機制的相關研究仍是空白。開展相關研究將為揭示弓形蟲攝取宿主營養(yǎng)物質的機制提供新思路。

在弓形蟲中，參與物質代謝的致密顆粒蛋白較少，目前報道只有GRA39參與弓形蟲的脂質代謝。GRA39定位于PV，參與Ⅱ型弓形蟲的脂質代謝，可通過調控弓形蟲脂質來影響蟲體的生長和毒力。缺失GRA39蛋白后，Ⅱ型弓形蟲蟲株脂質堆積顯著，且弓形蟲生長緩慢、毒力和組織包囊數(shù)均顯著下降。但缺失GRA39導致弓形蟲脂質堆積的原因尚不清楚，GRA39可能參與弓形蟲攝取脂質的轉運或脂質再利用的過程，進一步的相關研究將填補弓形蟲脂質代謝的部分空白。

2.4.4 參與對宿主可溶性蛋白質的攝取 與運輸相關的宿主內體分類復合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)除參與弓形蟲對宿主的入侵外，在弓形蟲復制時會被招募到PVM，參與對宿主細胞質內蛋白質的攝入。GRA14和其他致密顆粒蛋白會與ESCRT互作，介導攝取了宿主蛋白質的囊泡可以以依賴ESCRT機制的病毒樣粒子的出芽方式跨過PVM，進而消化吸收從宿主細胞質內獲取的蛋白。另外，IVN形成所需的GRA2也參與對宿主蛋白的吸收。GRA14雖定位于IVN，但其不參與IVN結構的形成。據(jù)此可推斷，GRA2缺失后，弓形蟲對宿主蛋白的吸收減少可能是由于IVN結構異常破壞了GRA14的分布、進而影響了GRA14與ESCRT的互作。IVN形成所需的其他致密顆粒蛋白可能會影響GRA14在IVN的分布，ESCRT也可能與其他致密顆粒蛋白間發(fā)生互作，這均需要進一步的研究證實。

2.5 參與弓形蟲的逸出

弓形蟲在宿主體內的擴散依賴于弓形蟲的逸出，弓形蟲從宿主細胞內逸出依賴于胞內鈣離子濃度的升高以及微線體蛋白的分泌。GRA8、GRA22和GRA41與弓形蟲在宿主細胞內的逸出存在關聯(lián)(表5)。GRA22定位于致密顆粒和PV，參與對弓形蟲逸出的調控；缺失GRA22后弓形蟲的逸出時間提前。定位于IVN的GRA41對維持弓形蟲的鈣離子穩(wěn)態(tài)至關重要。缺失GRA41后弓形蟲攝取胞外鈣離子的穩(wěn)態(tài)失調，從感染細胞內的逸出延遲。但GRA22和GRA41并非含有鈣離子結合位點，其影響弓形蟲逸出的機制可能與鈣離子穩(wěn)態(tài)無關；其能影響弓形蟲的逸出可能只是這兩種致密顆粒蛋白缺失間接導致的結果；而且具體因何種機制引起還需進一步的研究。另外，GRA8定位于PVM，是弓形蟲速殖子階段膜下細胞骨架的組成部分，與弓形蟲膜下細胞骨架的組織和運動相關；敲除Ⅰ型(RH株)蟲株的GRA8基因，可降低其對宿主細胞的入侵能力和從宿主細胞的逸出能力(表5)。

表5 參與逸出的致密顆粒蛋白Table 5 Dense granule proteins involved in egress

2.6 參與慢性感染中包囊的形成

針對GRAs的基本功能的研究主要聚焦在速殖子階段，但在免疫功能正常的情況下，速殖子轉化為生長較為緩慢的緩殖子，以包囊的形式存在于骨骼、心、腦組織中，建立慢性感染。一旦宿主免疫力下降，會導致嚴重的甚至致命的弓形蟲腦炎。研究發(fā)現(xiàn)，多種致密顆粒蛋白也參與弓形蟲的慢性感染，在包囊的形成中發(fā)揮重要作用(表6)。

表6 參與慢性感染中包囊形成的致密顆粒蛋白Table 6 Dense granule proteins involved in cyst formation in chronic infection

主要定位于PVM的GRA3、GRA5、GRA7、GRA8、GRA9、GRA14和GRA17參與包囊的形成，這類蛋白缺失后，弓形蟲慢性感染階段的小鼠腦包囊數(shù)顯著減少。在包囊發(fā)育和成熟階段，GRA3和GRA14影響包囊囊壁組成物質在囊壁周圍的積聚率，其在Ⅱ型弓形蟲的缺失可顯著減少感染小鼠體內的包囊數(shù)量；定位于包囊膜的GRA17可介導物質的轉運、調節(jié)緩殖子在包囊內的活力；GRA3和GRA7介導囊壁和囊膜的發(fā)育和成熟；GRA7和GRA5在整個包囊發(fā)育過程中定位于囊膜和囊壁區(qū)域，有助于PVM保持完整并發(fā)育成囊膜。GRA8與GRA3、GRA7、GRA9和GRA14一致，其基因敲除后，感染小鼠的腦包囊數(shù)可減少60%～80%。

與IVN相關的GRA2、GRA4、GRA6、GRA9、GRA12對囊壁和囊膜的發(fā)育和成熟也至關重要。缺失GRA2、GRA4和GRA6后，弓形蟲在小鼠慢性感染階段形成的腦包囊數(shù)可顯著減少90%。缺失GRA12后，慢性感染小鼠中形成的腦包囊數(shù)幾乎完全消失；而與GRA12同源的GRA12A、GRA12B和GRA12D在弓形蟲慢性感染中參與包囊的形成、成熟與激活。

部分在緩殖子階段表達量高的致密顆粒蛋白也參與包囊的形成。GRA50～GRA53均定位于囊壁，屬于囊壁蛋白(CST)。CST1、GRA50(CST2)缺失后，包囊囊壁變得脆弱，且在慢性感染中形成的腦包囊數(shù)顯著減少。另外，定位于PV的GRA55和GRA39對小鼠腦包囊的形成或維持也是至關重要的。

目前，參與慢性感染中包囊建立的多個致密顆粒蛋白已被鑒定，但這類致密顆粒蛋白可能是作為調節(jié)因子調控包囊的形成，也可能是包囊的結構性組成成分。磷酸化研究表明，參與包囊建立的多種致密顆粒蛋白在緩殖子階段和速殖子階段的磷酸化水平不同。由此推斷，在包囊轉化過程中，致密顆粒蛋白被磷酸化可能是一種調控致密顆粒蛋白在包囊分布的方式。因此，進一步研究含有磷酸化位點的致密顆粒蛋白在緩殖子階段的功能，以及深入研究包囊囊壁、囊膜的組成成分，將進一步揭示弓形蟲在慢性感染階段轉化為包囊的機制。

3 小 結

近年來，CRISPR-Cas9基因編輯技術在弓形蟲研究中得到了廣泛的應用，針對弓形蟲重要基因和蛋白質生物學功能、致病機制、藥物靶點以及疫苗的研究也不斷展開。目前尚未研制出安全有效的防控弓形蟲病的理想藥物或疫苗。致密顆粒蛋白作為弓形蟲一類重要的分泌蛋白質，不僅種類豐富，而且參與調控宿主細胞信號傳導和基因表達以及免疫逃避、營養(yǎng)物質的攝取等重要的生物學過程?；蚪M學、轉錄組學、蛋白組學等組學技術和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)、鄰近依賴生物素鑒定(proximity-dependent biotin identification，BioID)等互作技術在弓形蟲研究中的應用，將有助于深入挖掘不同階段或參與不同功能的致密顆粒蛋白。CRISPR-Cas9基因編輯技術則可幫助人們高效地構建致密顆粒蛋白的基因缺失株，進而深入研究其生物學功能。因此，進一步挖掘并探索弓形蟲的新型致密顆粒蛋白及其生物學功能，將推動弓形蟲致病機制的研究和抗弓形蟲疫苗或潛在藥物的研發(fā)。