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        切花小菊“紅昌”脫毒技術(shù)研究

        2022-10-29 04:49:26陳天烺吳海峰張賓賓赫文韜
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年19期
        關(guān)鍵詞:病毒唑小菊切花

        劉 丹,王 容,陳天烺,吳海峰,張賓賓,方 萍,陳 煒,赫文韜

        (浙江海豐生物科技股份有限公司,浙江紹興 312000)

        菊花(),為菊科菊屬多年生宿根草本花卉,是我國的傳統(tǒng)名花,被譽為花卉“四君子”之一。目前切花菊栽培地域廣泛,在花卉產(chǎn)業(yè)中占有重要地位,作為世界四大切花之一,在生產(chǎn)規(guī)模上居于世界各類切花之冠。切花菊又分為多頭和單頭兩大類,多頭切花菊又稱切花小菊,小菊的一個莖稈上有多個花蕾,一般為5~7個,花朵直徑6 cm以下,主蕾與側(cè)蕾長勢均衡,花期接近,呈傘形花序,觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值極高,在國內(nèi)和國際市場的需求量迅速增加。為了滿足市場需求,近年來,菊花栽培面積不斷擴(kuò)大,但菊花的病毒病越來越嚴(yán)重。已報道侵染菊花的病毒有20余種,如番茄不孕病毒(Tomatoa spermy virus,TAV)是危害菊花的主要病毒之一。TAV 為黃瓜花葉病毒屬的成員。侵染TAV病毒的菊花植株表現(xiàn)矮化、變形、碎花、花葉、皺縮、壞死等現(xiàn)象,嚴(yán)重影響菊花的品質(zhì)和產(chǎn)量,阻礙菊花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。筆者以切花小菊“紅昌”為試材,探究菊花脫毒技術(shù),以期為脫除菊花病毒及解決品種退化提供技術(shù)和數(shù)據(jù)參考。

        1 材料與方法

        供試脫毒材料:經(jīng)鑒定感染TAV病毒的小菊“紅昌”(采自浙江海豐花卉有限公司種植基地),該小菊為扦插培養(yǎng)18 d后得到的小菊幼苗,處于營養(yǎng)生長時期。

        病毒唑預(yù)脫毒。用一次性注射器在距離地面2 cm的小菊“紅昌”植株莖稈上注射病毒唑溶液,溶液濃度分別為0(CK)、5、10、15、20 mg/L。培養(yǎng)條件:空氣濕度為50%~75%,環(huán)境溫度為15~30 ℃,光照時間為14 h/d,光照強度為50 000~100 000 lx。培養(yǎng)期間注意防蟲防菌,培養(yǎng)30 d后得到預(yù)脫毒小菊。

        外植體的無菌培養(yǎng)。選取獲得的預(yù)脫毒小菊當(dāng)年生嫩枝,剪去葉片,將其莖段剪成帶4~5個芽的小段,在洗潔精水中浸泡10 min,取出將每個帶芽莖段單獨用自來水流水沖洗1 min;然后將清洗后的帶芽莖段在多菌靈1 000倍液中浸泡30 min,取出單獨用自來水流水沖洗1 min;在超凈工作臺上將清洗后的帶芽莖段在75%乙醇溶液中浸泡30 s,取出用無菌水沖洗2次;最后將沖洗后的帶芽莖段在有效氯為5%次氯酸鈉溶液中浸泡10 min,取出用無菌水沖洗6次,每次沖洗1 min,得到消毒滅菌后的莖段。將獲得的莖段切成長2~3 cm的小段,每個小段帶有1~3個腋芽,同時切除莖段兩端2~3 mm接觸藥品的部位,將其接種于含有不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS(3/4大量元素)+6-BA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L的組培瓶內(nèi)進(jìn)行初代培養(yǎng)。25 d繼代培養(yǎng)一次,繼代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+活性炭0.5 g/L。培養(yǎng)條件:溫度為(22±2) ℃,光照強度為2 000 lx,光照時間為14 h/d。

        熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒。將繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 d得到的無菌瓶苗在光照培養(yǎng)室中培養(yǎng)7 d后置于光照培養(yǎng)箱內(nèi),采用晝夜變溫的方式進(jìn)行熱處理,進(jìn)一步提高莖尖的脫毒率。設(shè)置2種熱處理方式:處理T,熱處理35 d;第1~5天:白天(8:00—20:00)高溫28 ℃,晚上(20:00—次日8:00)低溫25 ℃;第6~12天:白天(8:00—20:00)高溫33 ℃,晚上(20:00—次日8:00)低溫28 ℃;第13—35天:白天(8:00—20:00)高溫39 ℃,晚上(20:00—次日8:00)低溫33 ℃,濕度均為30%~50%。處理T,光照時間12 h/d,光照強度3 000 lx,按晝夜溫度28~32、30~35、33~38 ℃的順序,每2 d變換1檔。然后在33~38 ℃下繼續(xù)熱處理脫毒培養(yǎng)30 d。熱處理培養(yǎng)后進(jìn)行莖尖剝離。

        莖尖剝離、接種與培養(yǎng)。將經(jīng)過熱處理的無菌苗在超凈工作臺上用鑷子和刀片切下菊苗頂端1~2 cm,接種于含有莖尖固定培養(yǎng)基MS+瓊脂5 g/L的培養(yǎng)皿中,以防在莖尖剝離過程中由于脫水而影響成活率(以不使用莖尖固定培養(yǎng)基直接剝離作為對照)。在40倍解剖鏡下,一手用鑷子輕輕將材料固定于視野中,另一手用11號手術(shù)刀將菊花頂芽外的幼小葉片小心依次剝離,注意操作過程中不要過早折斷莖,以免增加剝離難度,直至在解剖鏡下能看清表面光滑、呈圓盤狀輕微發(fā)亮的莖尖為止。用手術(shù)刀割取莖尖組織,大小分別為0.1~0.3、0.8、1.5、1.9 mm,然后迅速接種于莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),pH 6.0,接種時輕輕放置于培養(yǎng)基表面,避免將莖尖深埋培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件:溫度為(22±2) ℃,光照強度為2 000 lx,光照時間為14 h/d,30 d后統(tǒng)計莖尖成活率。

        莖尖成活率=(莖尖成活數(shù)/接種莖尖總數(shù))×100%

        莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基的不同配方:CHR-1,改良MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L;CHR-2,MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L;CHR-3,ZL+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L;CHR-4,1/2B5+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L(ZL為申請公布號為“CN109258460A”發(fā)明專利中的培養(yǎng)基組成成分)。

        病毒檢測。對所得的小菊植株(莖尖組織培養(yǎng)苗)進(jìn)行TAV檢測,統(tǒng)計脫毒率確定脫毒效果。

        脫毒率=(脫毒植株數(shù)/熱處理植株數(shù))×100%

        增殖培養(yǎng)。將獲得的經(jīng)鑒定確認(rèn)不攜帶TAV病毒的小菊植株接種至增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng),培養(yǎng)條件:溫度為(22±2) ℃,光照強度為2 000 lx,光照時間為14 h/d。

        生根培養(yǎng)。將增殖后的脫毒植株切成2 cm左右并帶有1~3個葉芽的莖段,接種于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:溫度為(22±2) ℃,光照強度為2 000 lx,光照時間為14 h/d。

        2 結(jié)果與分析

        經(jīng)RT-PCR檢測,小菊“紅昌”脫毒前感染TAV的結(jié)果呈陽性(圖1)。

        注:M.Marker;1.陰性對照;2.供試脫毒材料TAV病毒的檢測結(jié)果Note:M.Marker;1.Negative control;2.TAV test results of the tested virus-free material圖1 TAV病毒檢測結(jié)果Fig.1 Test result of TAV

        由表1可知,采用不同濃度病毒唑?qū)π【者M(jìn)行預(yù)脫毒處理,小菊的脫毒率不同,以處理③的脫毒率最高,達(dá)92.50%;CK的脫毒率最低。部分莖尖組織培養(yǎng)苗的病毒檢測結(jié)果呈陽性(圖2),說明病毒唑預(yù)脫毒對菊花脫毒有重要作用。

        表1 不同濃度病毒唑?qū)γ摱韭实挠绊?/p>

        注:M.Marker;1.陰性對照;2.供試脫毒材料TAV病毒的檢測結(jié)果Note:M.Marker;1.Negative control;2.TAV test results of the tested virus-free material圖2 未經(jīng)病毒唑預(yù)脫除TAV病毒檢測結(jié)果Fig.2 Detection results of TAV virus without virazole pre removal

        由表2可知,2種不同熱處理方式對小菊脫毒率的影響呈極顯著差異;處理T,病毒唑濃度及莖尖剝離大小均一致時,熱處理溫度采用25~39 ℃的方式,脫毒率極顯著高于處理T,達(dá)92.50%。因此,熱處理溫度為25~39 ℃是熱處理結(jié)合莖尖脫毒的最佳溫度。無菌瓶苗在熱處理前狀態(tài)見圖3,熱處理后狀態(tài)見圖4。

        表2 不同熱處理溫度對脫毒率的影響

        圖3 無菌苗熱處理前Fig.3 Sterile seedlings before heat treatment

        圖4 無菌苗熱處理后Fig.4 Sterile seedlings after heat treatment

        由表3可知,剝離莖尖大小為0.1~0.3 mm,莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為CHR-1時,莖尖的存活率最高,達(dá)53.33%。因此,莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基CHR-1時,即改良MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L為最適合莖尖培養(yǎng)的培養(yǎng)基。莖尖培養(yǎng)30 d的狀態(tài)見圖5,莖尖培養(yǎng)60 d的狀態(tài)見圖6。

        表3 不同莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基對莖尖成活率的影響

        圖5 莖尖培養(yǎng)30 d的狀態(tài)Fig.5 The state of shoot tip culture for 30 days

        圖6 莖尖培養(yǎng)60 d的狀態(tài)Fig.6 The state of shoot tip culture for 60 days

        由表4可知,莖尖大小為0.1~0.3 mm,莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為CHR-1時,小菊的脫毒率最高,達(dá)89.00%;且莖尖增大,小菊的脫毒率降低,說明莖尖越小,病毒的數(shù)量越少,越有利于小菊脫除病毒。因此,莖尖大小為0.1~0.3 mm(圖7),有助于病毒的脫除,提高脫毒率。

        由表5可知,莖尖大小相同時,剝離莖尖時采用莖尖固定培養(yǎng)基和不采用莖尖固定培養(yǎng)基的小菊莖尖存活率有著明顯差異。處理①,采用莖尖固定培養(yǎng)基,莖尖大小為0.1~0.3 mm時,莖尖存活率最高,達(dá)60.00%。由此說明,剝離莖尖時,采用莖尖固定培養(yǎng)基能提高莖尖的存活率。

        表4 不同大小莖尖對脫毒率的影響

        圖7 0.1~0.3 mm的莖尖Fig.7 0.1-0.3 mm stem tip

        表5 莖尖固定培養(yǎng)基對莖尖成活率的影響

        經(jīng)病毒唑預(yù)脫毒,熱處理結(jié)合莖尖剝離及莖尖培養(yǎng)得到脫毒無菌苗,通過RT-PCR檢測無菌苗是否脫除TAV:首先提取待測無菌苗的RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;以cDNA為模板,采用TAV-F1和TAV-R1進(jìn)行第1輪PCR反應(yīng),得到第1輪PCR產(chǎn)物;以第1輪PCR產(chǎn)物為模板,采用TAV-F2和TAV-R2進(jìn)行第2輪PCR,得到第2輪PCR產(chǎn)物(終產(chǎn)物)。引物序列如下:

        TAV-F1:CCATCCCTTCAACATCCGAC

        TAV-R1:GTTGAAGCGGAAGGAATACG

        TAV-F2:TTATTGCTGGGAAGAAGTGTCG

        TAV-R2:CGGTGGGAACGTGCTGAT

        圖8為脫毒后植株病毒檢測結(jié)果,結(jié)果顯示呈陰性。

        注:M.Marker;1.陰性對照;2.莖尖組織培養(yǎng)苗TAV檢測Note:M.Marker;1.Negative control;2.TAV test results of shoot tip tissue culture seedling圖8 脫毒后TAV病毒檢測結(jié)果Fig.8 Test results of TAV virus after virus removal

        將獲得的經(jīng)鑒定后確認(rèn)不攜帶TAV病毒的小菊植株接種至增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng),在溫度為(22±2) ℃,光照強度為2 000 lx,光照時間為14 h/d的條件下培養(yǎng)30 d后,得到增殖后的脫毒植株(圖9),葉色濃綠,長勢較好。

        圖9 增殖狀態(tài)的脫毒苗Fig.9 Virus free seedling in proliferation

        將增殖后的脫毒植株切成2 cm左右并帶有1~3個葉芽的莖段,接種于生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng),培養(yǎng)5~7 d后可明顯觀察到根系長出,在生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)30 d后,得到脫毒生根苗(圖10),植株健壯,根系發(fā)達(dá)。

        圖10 生根狀態(tài)的脫毒苗Fig.10 Virus free seedlings in rooting state

        3 討論與結(jié)論

        目前,有關(guān)菊花脫除病毒技術(shù)的研究已經(jīng)有大量報道。國內(nèi)外報道的侵染菊花的病毒種類多,特點不同,脫除難易程度也不同,因此不同的脫毒方法和病毒檢測技術(shù)不斷被研究和分析。何旭君等以“增城蜜菊”無菌瓶苗為材料,對脫除菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)和番茄不孕病毒(TAV)進(jìn)行了研究,得出最佳莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.1 mg/L+椰子汁100 ml/L+蔗糖30 g/L,誘導(dǎo)率為52.67%的結(jié)論,而該研究的最佳莖尖誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+活性炭0.5 g/L+蔗糖30 g/L+瓊脂5 g/L,莖尖的成活率為53.33%,與何旭君等研究的誘導(dǎo)率相差不多。宋瑞琳等以切花菊為材料,采用熱處理結(jié)合2次莖尖組織培養(yǎng)技術(shù)脫除TAV,莖尖取0.5~1.0 mm,熱處理溫度白天40 ℃,夜間30 ℃,脫毒率達(dá)83.3%~90.00%;而該研究的熱處理溫度為25~39 ℃,莖尖大小為0.1~0.3 mm,脫毒率略高于前者,為89.00%~92.50%。魏進(jìn)莉研究結(jié)果表明,剝?nèi)〉那o尖大小在0.1~0.3 mm時,病毒可100%被脫除,且與該研究中隨著剝?nèi)∏o尖大小的增大,脫毒效果降低結(jié)論一致。吳丹等以莖尖分生組織培養(yǎng)結(jié)合熱處理或病毒唑處理脫除“滁菊”病毒效果明顯,與該研究采用病毒唑10 mg/L進(jìn)行預(yù)脫毒處理的結(jié)果類似。該試驗的脫毒方法可為菊花的母本復(fù)壯和病毒脫除提供技術(shù)參考。

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