區(qū)美怡

(溫氏食品集團(tuán)股份有限公司//農(nóng)業(yè)部動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 云浮 527400)

色氨酸(Trp)，又名α-氨基-β-吲哚丙酸，在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育中不可或缺，一方面色氨酸可以促進(jìn)動(dòng)物肝臟蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)和代謝；另一方面色氨酸在動(dòng)物代謝過(guò)程中轉(zhuǎn)化的5-羥色胺、喹啉酸、犬尿氨酸、褪黑激素等產(chǎn)物在調(diào)節(jié)畜禽的采食量、繁殖、神經(jīng)功能、抗應(yīng)激和免疫反應(yīng)上發(fā)揮重要作用[1-2]。大量研究表明，適當(dāng)提高飼糧色氨酸水平，能顯著改善畜禽的生長(zhǎng)和繁殖性能[3-5]。

酸水解作為氨基酸檢測(cè)的前處理方法，會(huì)破壞樣品中的色氨酸，目前普遍采取堿水解單獨(dú)對(duì)色氨酸樣品進(jìn)行前處理。色氨酸的檢測(cè)方法主要有熒光法、氨基酸分析法、液相色譜法等[6-10]。檢測(cè)過(guò)程中使用堿解劑的種類、濃度和用量、流動(dòng)相pH值、堿水解時(shí)間等因素均會(huì)對(duì)色氨酸的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響[11-13]。本試驗(yàn)選取常規(guī)的植物性和動(dòng)物性飼料為研究對(duì)象，樣品經(jīng)過(guò)堿水解處理，采用高效液相色譜法測(cè)定，該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters超高效液相色譜儀(ACQUITY UPLC H-Class)，配紫外檢測(cè)器；艾本德離心機(jī)(Centrifuge 5804R)；氮吹裝置；鼓風(fēng)干燥箱；梅特勒-托利多萬(wàn)分之一分析天平(±0.000 1 g)；梅特勒-托利多十萬(wàn)分之一分析天平(±0.000 01 g)；梅特勒-托利多pH計(jì)；塑料螺紋安瓿瓶；容量瓶。

甲醇：色譜純；冰乙酸：優(yōu)級(jí)純；試驗(yàn)用水：超純水；乙酸鈉緩沖液(pH=4.5)：稱量0.70 g無(wú)水乙酸鈉，加入1 000 ml水，攪拌溶解，用冰乙酸調(diào)節(jié)緩沖液至pH=4.5；氫氧化鋰溶液(4 mol/L)：稱量33.6 g氫氧化鋰，加入200 ml水，攪拌溶解。

試驗(yàn)飼料樣品均收集于溫氏集團(tuán)下屬飼料廠，樣品用中藥粉碎機(jī)粉碎過(guò)0.25 mm孔篩，密封保存待測(cè)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱取約0.025 g(精確到0.000 01 g)色氨酸對(duì)照品(Sigma 純度≥99.5%)，置于塑料螺紋安瓿瓶中，加入3 ml氫氧化鋰溶液，氮吹2 min后立即擰緊瓶蓋。在110±1℃烘箱中反應(yīng)20 h，取出冷卻至室溫，用乙酸鈉緩沖液將堿解液轉(zhuǎn)移并定容至50 ml棕色容量瓶中，搖勻靜置，即得色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，在2～8℃保存，有效期7 d。

1.2.2樣品前處理

飼料樣品用分樣器縮減取樣，經(jīng)高速中藥粉碎機(jī)粉碎過(guò)0.25 mm孔篩，混勻后密封保存，備用。稱取粉碎后的飼料樣品0.1～0.2 g(精確到0.000 1 g)，置于安瓿瓶中，加入3 ml氫氧化鋰溶液，氮吹2 min后立即擰緊瓶蓋。在110±1℃烘箱中水解20 h，取出冷卻至室溫。用乙酸鈉緩沖液將堿解液轉(zhuǎn)移并定容至50 ml棕色容量瓶中，搖勻靜置，取上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾，供上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3色譜分析條件

色譜柱:Waters XBridge?BEH C18柱(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)；紫外波長(zhǎng)：280 nm；流動(dòng)相：乙酸鈉緩沖溶液(pH=4.5)+甲醇=95+5；柱溫：25℃；流速：0.2 ml/min，進(jìn)樣量：10 μl。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法檢測(cè)限及線性范圍

準(zhǔn)確吸取色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液10 ml，用乙酸鈉緩沖液(pH=4.5)稀釋成系列濃度色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。試驗(yàn)按照1.2.3的色譜條件進(jìn)行分析，得到以色氨酸濃度c為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖1所示。色氨酸的線性回歸方程為：A=16 360c+88 376，線性范圍為6.977～558.195 mg/L，R2=0.999 6，分別以3倍噪音水平和10倍噪音水平計(jì)算檢出限和定量限。經(jīng)過(guò)計(jì)算，檢出限為17.32 ng/kg，定量限為191.22 ng/kg。樣品空白添加定量限濃度，計(jì)算得出定量限回收率為100.07%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確可靠。

圖1 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.2 方法的精密度和準(zhǔn)確度

取豆粕平行樣5份，按照1.2的試驗(yàn)方法同時(shí)處理樣品，5份豆粕樣品中色氨酸的平均含量為5.04 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為0.69%，此檢測(cè)方法重復(fù)性良好，檢測(cè)結(jié)果如表1所示。選取2種飼料原料，加入3種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，按照1.2的試驗(yàn)方法，測(cè)定色氨酸的加標(biāo)回收率，計(jì)算得出加標(biāo)回收率為90.15%～105.39%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表1 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

表2 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果

2.3 樣品的測(cè)定

將色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和飼料原料按1.2試驗(yàn)方法進(jìn)行分析，圖2、圖3分別為色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖，液相色譜圖顯示，色氨酸在本試驗(yàn)色譜條件下的出峰時(shí)間大約在9.4 min，色譜峰窄而尖，分離效果良好。

圖2 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖3 豆粕樣品色譜圖

采用1.2試驗(yàn)方法與國(guó)標(biāo)方法[10]測(cè)定植物性原料和動(dòng)物性原料樣品中的色氨酸含量，結(jié)果顯示兩個(gè)方法的結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定一致，表明本試驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠，方法的比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表3。

分別收集常規(guī)的高蛋白飼料和低蛋白飼料樣品數(shù)種，按1.2前處理方法及液相色譜條件測(cè)定樣品中色氨酸的含量，采用凱氏定氮法[14]同步測(cè)定對(duì)應(yīng)樣品的粗蛋白質(zhì)含量。色氨酸與粗蛋白質(zhì)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

表4 部分低蛋白原料中色氨酸和粗蛋白質(zhì)含量

表5 部分高蛋白原料中色氨酸和粗蛋白質(zhì)的含量

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用反向高效液相色譜法測(cè)定飼料原料中色氨酸的含量。色氨酸的質(zhì)量濃度范圍在6.977～558.195 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好(R2= 0.999 6)，該實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單可靠，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和加標(biāo)回收率分別為0.69%和90.15%～105.39%，表明此方法精密度和準(zhǔn)確度符合檢測(cè)要求。收集不同種類的植物性和動(dòng)物性飼料原料，同步進(jìn)行粗蛋白質(zhì)和色氨酸的檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，高蛋白原料色氨酸的含量普遍高于低蛋白原料樣品。