黃艷花，崔忠吉，歐善生，黃遠(yuǎn)光，蒙 成，李楊秀

(1.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，南寧 530007；2.廣西梧州市長(zhǎng)洲區(qū)倒水鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，廣西 梧州 543006)

【研究意義】西番蓮(Passifloraedulis)是西番蓮科(Passiflo-raceae)西番蓮屬(PassifloraL.)草質(zhì)藤本植物[1]，原產(chǎn)于澳大利亞和南美洲的巴西，現(xiàn)廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[2]。其果汁可散發(fā)出番桃、草莓、檸檬、芒果、菠蘿、香蕉、石榴和酸梅等130多種水果的芳香物質(zhì)，因此又名百香果，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[3-4]。在我國(guó)南亞熱帶地區(qū)，西番蓮被列為重點(diǎn)開(kāi)發(fā)作物之一，西番蓮飲料被我國(guó)多省區(qū)列為科技攻關(guān)項(xiàng)目及出口創(chuàng)匯發(fā)展項(xiàng)目[5]。近年來(lái)，廣西、福建和貴州等地西番蓮種植面積迅速增加[1]，但各種病害發(fā)生也日益嚴(yán)重，目前報(bào)道較多的有病毒病、莖基腐病、疫病、炭疽病、灰霉病、根腐病、褐斑病、煤煙病、灰霉病和立枯病等[6-7]。2021年9月，本研究團(tuán)隊(duì)在廣西南寧市西番蓮試驗(yàn)基地發(fā)現(xiàn)1種新型頂枯病，嚴(yán)重時(shí)植株整株枯死，2021年12月對(duì)廣西南寧市3個(gè)西番蓮試驗(yàn)基地進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病率達(dá)49.5%，已對(duì)西番蓮生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害。但該病害屬于西番蓮發(fā)生的新病害，尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，準(zhǔn)確鑒定該病害的病原菌，明確其分類地位，對(duì)西番蓮頂枯病科學(xué)防控及西番蓮產(chǎn)業(yè)的持續(xù)快速發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前報(bào)道的頂枯類病害主要由真菌性和細(xì)菌性病原菌引起，其中多數(shù)為真菌性病害，主要有灰氈毛忍冬頂枯病(Neofu-sicoccumparvum和Botryo-sphaeriadothidea)[8]、大麻頂枯病(Fusariumchlamydosporum)[9]、芒果頂枯病(Botryospbaeriaribis)[10]、杉木頂枯病[Pestalotiopsisapiculatus(Huang) Huang][11]、葡萄頂枯病(Eutypellavitis)[12]和茉莉頂枯病(Phomopsissp.)[13]。而細(xì)菌性病害主要為大豆頂枯病(Rickettsia-likebactenia)[14]和苦楝頂枯病(Bacteria—likeorganisms)[15]。上述頂枯類病害均有一個(gè)共同特征，即病部從枝條頂端開(kāi)始發(fā)病，逐漸向下發(fā)展并產(chǎn)生死芽及枯枝。筆者將符合該癥狀的西番蓮新病害稱為西番蓮頂枯病，其特征為發(fā)病初期在西番蓮芽頂產(chǎn)生黑褐色濕腐狀病斑，頂芽壞死，發(fā)病后病斑逐漸由頂端向下擴(kuò)展，引起枝條由頂端向下枯萎，枝條節(jié)間及葉片不變形，發(fā)病部位葉片黃化枯死不脫落，病部有大量黑色小顆粒物，與徐平東等[16]報(bào)道西番蓮死頂病病原菌為黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaiccucumorirus，CMV)，主要癥狀為死頂、葉片黃化和節(jié)間縮短等特征區(qū)別明顯?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，針對(duì)西番蓮頂枯病病原菌鑒定的研究未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)引起西番蓮頂枯病的病原菌仍未明確?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)西番蓮頂枯病病原菌分離、致病性測(cè)定、形態(tài)特征觀察及核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、鈣調(diào)蛋白(CAL)和交配型基因(ApMat)多基因序列分析，鑒定、明確引起西番蓮頂枯病的病原菌，為今后開(kāi)展該病害科學(xué)防控及促進(jìn)西番蓮產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年9—12月在廣西南寧市廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)植保實(shí)訓(xùn)基地百香果試驗(yàn)基地(108°21′E，22°49′N)進(jìn)行。西番蓮品種為臺(tái)農(nóng)1號(hào)，種植時(shí)間為2021年3月，前作為臺(tái)農(nóng)1號(hào)西番蓮，頂棚架式種植，常規(guī)管理。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病害癥狀觀察及發(fā)病情況調(diào)查 在田間隨機(jī)連片調(diào)查西番蓮植株200株，觀察其發(fā)病情況，統(tǒng)計(jì)發(fā)病率[發(fā)病率(%)=發(fā)病芽數(shù)/調(diào)查總芽數(shù)×100[18]]，拍攝病害特征照片，采集病害樣本并帶回實(shí)驗(yàn)室徒手切片制作臨時(shí)玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌菌絲和孢子形態(tài)并拍照保存。

1.2.2 病原菌分離與純化 采集癥狀典型、病斑新鮮的百香果頂枯病病株帶回實(shí)驗(yàn)室，采用植物病原真菌組織分離法進(jìn)行病原菌分離[17]。于百香果病株病健交界處切取規(guī)格為0.4 cm×0.5 cm的組織塊，用75%乙醇消毒20～40 s，然后移入10%次氯酸鈉溶液消毒3 min，最后用無(wú)菌水沖洗4次，用滅菌濾紙吸干組織表面水分后接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，培養(yǎng)皿倒置，于28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)2～3 d，長(zhǎng)出菌絲后在菌落邊緣用無(wú)菌鑷子剪取形態(tài)單一的小菌絲塊接種至PDA培養(yǎng)基進(jìn)行純化。培養(yǎng)6 d待菌落長(zhǎng)出孢子后采用標(biāo)記法進(jìn)行單細(xì)孢純化，在90 mm培養(yǎng)皿中倒入10 mL薄層PDA培養(yǎng)基，將濃度為1.00×103個(gè)/mL的孢子懸浮液布滿在培養(yǎng)基上，用封口薄膜將培養(yǎng)皿密封，移入28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～10 h；用徠卡生物顯微鏡物鏡10倍鏡頭從培養(yǎng)皿反面檢查，挑選在視野內(nèi)只有1個(gè)已經(jīng)萌發(fā)但其附近沒(méi)有其他孢子或菌絲存在的孢子，用記號(hào)筆對(duì)著孢子所在位置在培養(yǎng)皿反面畫(huà)一個(gè)小點(diǎn)作記號(hào)，培養(yǎng)皿繼續(xù)置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d，標(biāo)記處孢子長(zhǎng)出的菌落即為該病菌單孢菌落。選取標(biāo)記位置只有1個(gè)獨(dú)立菌落的菌落轉(zhuǎn)移到新的PDA試管斜面上培養(yǎng)5 d，再將長(zhǎng)滿菌絲的斜面試管放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹18]。

1.2.3 病原菌致病性測(cè)定 菌絲塊接種法。將單孢純化保存的病原菌活化后接種至PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)6 d，用直徑5.00 mm的打孔器打取菌絲塊。選取苗齡為4個(gè)月的健康西番蓮扦插小杯苗，先用無(wú)菌水將小杯苗地上部清洗干凈，待表面殘留水分晾干后，在苗的芽頂用一次性醫(yī)用針頭輕扎3個(gè)距離小于5.00 mm的淺孔，然后挑取制備好的菌絲塊置于刺傷部位，帶菌絲的菌碟面接觸枝條，用薄層醫(yī)用脫脂棉浸濕無(wú)菌水后纏繞接種部位，外包保鮮膜保濕，接種后每天葉面噴霧、根部淋水保濕7 d。3次重復(fù)，每重復(fù)接種5株，以不帶菌PDA培養(yǎng)基塊為對(duì)照組。接種發(fā)病后從病斑上再次分離病原菌，進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證。

孢子懸浮液接種法。將單孢純化保存的病原菌活化后接種至PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌水刷洗孢子，配制成濃度為1.00×106個(gè)/mL的孢子懸浮液備用。用無(wú)菌水將苗齡為4個(gè)月的健康西番蓮扦插小杯苗地上部清洗干凈，待表面殘留水分晾干后，在苗的芽頂用一次性醫(yī)用針頭輕扎3個(gè)距離小于5.00 mm的淺孔，然后用小噴壺將配置好的孢子懸浮液噴霧到芽頂上，噴至頂芽全部濕潤(rùn)并剛好滴水后，用薄塑料袋將接種芽從上往下套住保濕。接種12 h后將塑料袋取出并每天葉面噴霧、根部淋水保濕7 d。3次重復(fù)，每重復(fù)接種5株，以噴霧無(wú)菌水為對(duì)照組。接種發(fā)病后從病斑上再次分離病原菌，進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.2.4 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定 將單細(xì)孢分離得到的病原菌在PDA培養(yǎng)基上活化，然后將菌塊(d=5.0 mm)接至新的PDA培養(yǎng)基上，黑暗條件下于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄PDA培養(yǎng)基上病原菌氣生菌絲的生長(zhǎng)狀況和菌落正反面顏色。采用十字交叉法定時(shí)測(cè)量菌落直徑，在光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌形態(tài)，用生物顯微鏡觀察菌絲和分生孢子形態(tài)，隨機(jī)選取100個(gè)分生孢子，測(cè)量其大小，參照李沛利等[19]的方法從形態(tài)上進(jìn)行初步鑒定。

1.2.5 病原菌分子生物學(xué)鑒定 病原菌純化菌絲體在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d，進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增。采用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒(杭州博日科技有限公司)提取病原菌DNA，引物送至北京擎科生物技術(shù)有限公司(南寧)合成；對(duì)病原真菌ITS[20]、CAL[21]和ApMat[20]基因序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，PCR擴(kuò)增所用引物信息見(jiàn)表1；以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物純度，測(cè)序及比對(duì)委托廣西南寧國(guó)拓生物科技有限公司完成。PCR反應(yīng)體系40 μL：上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，2×TaqPCR MasterMix 20 μL，加ddH2O至40 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，根據(jù)各引物退火溫度(表1)退火15 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。完成上述步驟后，在Biometra EasyCycler Gradient中進(jìn)行反應(yīng)；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至廣州擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，將所得基因序列上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，下載相似性高且同時(shí)含有ITS、CAL和ApMat基因序列的模式菌株及參考菌株序列，按照ITS、CAL和ApMat順序依次拼接，進(jìn)行同源性比較，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，bootstrap值設(shè)為1000，通過(guò)MEGA 6.0構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，確定病原菌的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 西番蓮頂枯病病害癥狀及發(fā)病情況

從圖1可看出，該病可危害頂芽和側(cè)芽，發(fā)病初期在西番蓮生長(zhǎng)點(diǎn)附近產(chǎn)生濕腐狀病斑，病部組織韌皮部和木質(zhì)部同時(shí)壞死，導(dǎo)致頂芽壞死，病斑組織失水黃化枯死，葉片不易掉落；濕度大時(shí)病部表皮軟化，病部組織易與木質(zhì)部分離，剝開(kāi)皮層后木質(zhì)部也有濕腐現(xiàn)象，在病部表面看到明顯的黑色小顆粒物即為病原菌分生孢子盤(pán)；病斑逐漸由頂端向下擴(kuò)展，枝條由上向下枯萎，嚴(yán)重時(shí)整株枯死。2021年12月調(diào)查統(tǒng)計(jì)，西番蓮頂枯病田間發(fā)病率達(dá)49.5%。

表1 PCR引物及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度信息

2.2 西番蓮頂枯病病原菌的致病性測(cè)定

從具有典型西番蓮頂枯病癥狀植株病部均分離到同一形態(tài)真菌，命名為T(mén)K2A2CLA6菌株，菌株活化后分別以菌絲塊和孢子懸浮液接種法接種到4月齡健康西番蓮扦插小杯苗頂芽上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種的頂芽發(fā)病率均為100.00%。其中，菌絲塊接種法接種2 d后，接種部位開(kāi)始出現(xiàn)水漬狀腐爛，接種處易折彎，5 d后頂芽失水壞死易掉落；孢子懸浮液接種法接種5 d后頂芽失水壞死；2種方法接種15 d時(shí)植株由頂芽往下3～4個(gè)芽節(jié)均干枯黃化壞死(圖2-A，2-B)，而對(duì)照組植株健康，無(wú)感病癥狀(圖2-C)；菌絲塊接種法接種容易引起芽頂斷落，孢子懸浮液接種法接種的芽頂不斷落，2種接種方法發(fā)病頂芽的其他癥狀與田間觀察到的發(fā)病癥狀均相似，病斑處組織失水黃化枯死，由頂端逐漸向下擴(kuò)散，枝條由上向下枯萎；植株發(fā)病后從發(fā)病部位再次分離獲得的病原菌形態(tài)特征與接種病原菌完全一致。說(shuō)明TK2A2CLA6菌株是西番蓮頂枯病的致病菌株。

2.3 西番蓮頂枯病病原菌的形態(tài)特征及分類地位

從圖3可看出，將分離得到的TK2A2CLA6菌株單孢純化后，菌落呈圓形或近圓形，正面產(chǎn)生灰白色氣生菌絲，菌絲發(fā)達(dá)且較致密(圖3-A)，菌落背面初期為淺黃色(圖3-B)；繼續(xù)培養(yǎng)到第7～8 d后菌落正面偶有橙色孢子堆產(chǎn)生(圖3-C)，菌落背面中央淺墨色、周圍淺黃色(圖3-D)。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌絲平均生長(zhǎng)速率為18.89 mm/d；分生孢子無(wú)色，近圓柱狀，兩端鈍圓，或一端鈍圓，另一端略細(xì)，一般具1～2個(gè)油球(圖3-E，3-F)，大小為(13.03～17.75) μm×(3.75～5.25) μm(平均為15.51 μm×4.70 μm，n=100)；TK2A2CLA6菌株病原菌菌絲和分生孢子的形態(tài)學(xué)特征與野外采集樣品徒手切片獲得的結(jié)果相同。根據(jù)病原菌形態(tài)學(xué)特征，參考李沛利等[20]的研究結(jié)果，初步判定TK2A2CLA6菌株是真菌界半知菌類腔孢綱黑盤(pán)孢目黑盤(pán)孢科炭疽菌屬真菌。

2.4 西番蓮頂枯病病原菌的多基因分子鑒定

分別使用引物ITS1/ITS4、CL1C Forward/CL2C Reverse和CgDL-F6 Forward/CgMAT1F2 Reverse對(duì)TK2A2CLA6菌株的ITS、CAL和ApMat基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為750、773和875 bp。將測(cè)序得到的3條序列上傳至GenBank，取得的登錄號(hào)分為OM2833599(ITS V1～V4區(qū))、OM302306(CAL)和 OM302307(ApMat)。將TK2A2CLA6菌株的3個(gè)基因序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與Colletotrichumsiamense多個(gè)序列的同源性達(dá)100%。從NCBI中下載13個(gè)Colletotrichum種使用MEGA 6.0鄰接法(NJ)構(gòu)建多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖4)，發(fā)現(xiàn)TK2A2CLA6菌株與C.siamenseLF177(KJ955092/KJ954645/KJ954508)和C.siamenseJH-Coll001(MK784123/MK784119/MK784118)以100%的自展支持率聚為獨(dú)立的1支，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，確定西番蓮頂枯病的致病菌是暹羅炭疽菌(C.siamense)。

3 討 論

炭疽屬真菌引起西番蓮病害已有不少報(bào)道。謝美華等[22]研究發(fā)現(xiàn)，刺盤(pán)孢屬(Colletotrichumsp.)是紫果西番蓮炭疽病的病原菌，危害紫果西番蓮葉片；冉飛等[23]研究認(rèn)為，喀斯特炭疽菌(C.karstii)引起西番蓮果實(shí)炭疽??；Du等[24]研究表明，C.brevisporum引起西番蓮莖、果實(shí)、葉和卷須疾病，典型癥狀包括橢圓形至不規(guī)則形狀的病變，發(fā)病部位棕色至棕黑色，并有凹陷空腔；Power等[25]研究指出，C.gloeosporioides引起西番蓮梢端節(jié)間伸長(zhǎng)減少，導(dǎo)致梢枯萎和死亡。本研究結(jié)果表明，暹羅炭疽菌是引起西番蓮頂枯病的病原菌，受該病原菌侵染后，西番蓮芽頂產(chǎn)生濕腐狀病斑，病部組織韌皮部和木質(zhì)部同時(shí)壞死，導(dǎo)致頂芽壞死，病斑處組織失水黃化枯死，葉片不易掉落，濕度大時(shí)病部表皮軟化，病部組織易與木質(zhì)部分離，剝開(kāi)皮層后木質(zhì)部也有濕腐現(xiàn)象，在病部表面可見(jiàn)明顯黑色小顆粒即為病原菌分生孢子盤(pán)，病斑逐漸由頂端向下擴(kuò)展，從而引起枝條由頂端向下枯萎，嚴(yán)重時(shí)整株枯死。

2009年在泰國(guó)首次發(fā)現(xiàn)暹羅炭疽菌侵染咖啡引發(fā)咖啡炭疽病[26]，其后發(fā)現(xiàn)其可與其他炭疽菌混合引發(fā)鵝掌柴炭疽病[19]、荔枝炭疽病[20]、油茶炭疽病[27]、臺(tái)農(nóng)芒果實(shí)采收后炭疽病[28]、南天竹炭疽病[29]、紅瑞木炭疽病[30]、紫山藥炭疽病[31]和灑金珊瑚炭疽病[32]等多種植物炭疽病，也可獨(dú)立引發(fā)楊桃采后炭疽病[33]、菠蘿蜜炭疽病[34]、多穗柯炭疽病[35]、棕竹炭疽病[36]、百日草炭疽病[37]、大葉黃楊炭疽病[38]和紅肉蘋(píng)果炭疽病[39]。暹羅炭疽菌侵染植物除引發(fā)炭疽類病害外，還能引起其他種類病害，如王芳等[40]研究發(fā)現(xiàn)，暹羅炭疽菌能獨(dú)立引發(fā)多肉植物青星美人黑腐病。本研究結(jié)果表明，暹羅炭疽菌能獨(dú)立引發(fā)西番蓮頂枯病。

炭疽屬真菌遺傳多樣性豐富，暹羅炭疽菌是膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)復(fù)合物的物種之一，由至少22個(gè)物種組成，僅憑病原菌菌落形態(tài)和分生孢子特征不能區(qū)分這些物種[37]。本研究中，TK2A2CLA6菌株形態(tài)學(xué)特征與膠孢炭疽菌復(fù)合物相似[20]，因此將其初步判斷為真菌炭疽屬；單獨(dú)使用ITS基因序列對(duì)TK2A2CLA6菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明TK2A2CLA6菌株與C.siamense、C.gloeosporioides和C.cobbittiense相似度均達(dá)100%，因此無(wú)法明確其具體種類，與李少卡等[20]研究認(rèn)為將ITS基因序列分析法用于炭疽菌屬真菌研究存在一定局限性的觀點(diǎn)一致。李少卡等[20]研究結(jié)果顯示，ApMat基因序列能很好地揭示膠孢炭疽菌復(fù)合群內(nèi)菌株的遺傳分化情況，考慮到在多數(shù)炭疽病鑒定中均使用CAL基因序列，本研究選擇ITS、CAL和ApMat基因序列對(duì)TK2A2CLA6菌株進(jìn)行多基因序列鑒定并建立多基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，成功將TK2A2CLA6菌株鑒定為C.siamense。

本研究中，從典型西番蓮頂枯病癥狀植株中分離所得TK2A2CLA6菌株的孢子與自然發(fā)病西番蓮枝條上切片觀察到的病原菌孢子形態(tài)一致，頂芽接種能使西番蓮發(fā)病，且發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀一致，再分離得到的病原菌與原接種病原菌一致，根據(jù)柯赫氏法則，確定TK2A2CLA6菌株是西番蓮頂枯病的病原菌，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)特征及多基因序列(ITS、CAL和ApMat)鑒定方法可確定西番蓮頂枯病的病原菌是暹羅炭疽菌。后續(xù)可進(jìn)一步探討西番蓮頂枯病病原菌暹羅炭疽菌的生物學(xué)特性和發(fā)生規(guī)律，開(kāi)展西番蓮頂枯病病原菌對(duì)殺菌劑的敏感性試驗(yàn)，篩選出安全、高效的防治藥劑，結(jié)合農(nóng)業(yè)栽培和生物防控措施，構(gòu)建完整的西番蓮頂枯病綜合防控技術(shù)體系，以有效防控該病害的發(fā)生和蔓延。

4 結(jié) 論

本研究使用形態(tài)學(xué)方法結(jié)合多基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，明確危害廣西南寧西番蓮頂枯病的病原菌為暹羅炭疽菌，可用于指導(dǎo)西番蓮頂枯病診斷與防治。