張永鵬，楊鈺澤，咸文榮，馬永強(qiáng)

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，西寧 810016；2.農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，西寧 810016；3.青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016)

【研究意義】馬鈴薯是世界上重要的糧食作物之一，隨著我國主糧化戰(zhàn)略的推進(jìn)，在保障糧食安全方面占有舉足輕重的地位。然而，在馬鈴薯生產(chǎn)過程中，常伴有各種病毒的危害，導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量降低和品質(zhì)變劣。事實(shí)證明馬鈴薯種薯生產(chǎn)環(huán)節(jié)的病毒檢測是保證種薯質(zhì)量的關(guān)鍵。因此，明確不同地區(qū)馬鈴薯病毒病的種類和發(fā)生情況，對當(dāng)?shù)伛R鈴薯病毒病的防控和馬鈴薯種薯質(zhì)量的提升有重要意義。馬鈴薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)被認(rèn)為是分布廣泛且危害嚴(yán)重的病毒之一，常以單獨(dú)和與其它病毒復(fù)合侵染形式存在，嚴(yán)重時(shí)造成的產(chǎn)量損失可達(dá)80%以上[1-2]，是馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)代表種。青海省是我國西北馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)之一和重要的種薯繁育基地，種薯調(diào)運(yùn)和種質(zhì)資源交流的日益頻繁促進(jìn)了PVY不同株系在不同地區(qū)之間的傳播，加速了新的重組株系的產(chǎn)生，提升了人們監(jiān)測防控該病毒的難度?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)因其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、操作簡便、結(jié)果獲得容易且可用于大規(guī)模檢測樣品等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于檢測和調(diào)查田間發(fā)病植物的病毒種類及株系[3-5]。Yardumncr等[6]在2009—2010年期間從土耳其阿菲勇地區(qū)試驗(yàn)田中采集278個(gè)樣本，通過雙抗體酶聯(lián)免疫吸附測定(DAS-ELISA)發(fā)現(xiàn)87.45%的測試樣品中含有PVY、PVX等種或多種病毒。Ellis等[7]在1996年根據(jù)PVY分離物的血清學(xué)特性將其分為3個(gè)血清組，分別為PVYO+C、PVYC和PVYN，其中PVYO、PVYC、PVYZ、 PVYN:O和PVYNTN-NW株系屬于PVYO+C血清型。PVYN、PVYNTN株系屬于PVYN血清型，PVYC血清型只包括PVYC株系。Kisten等[8]在2015年對南非夸祖魯納塔爾地區(qū)疑似病毒病侵染的番茄、草莓樣品利用PVYN、PVYO+C特異性抗體進(jìn)行DAS-ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)所有樣品均與PVYO+C抗體呈陽性反應(yīng)，表明該地區(qū)有PVYO、PVYC、PVYZ、PVYN:O和PVYNTN-NW株系存在的可能性。Tian等[9]在2011年對中國煙草中馬鈴薯Y病毒遺傳多樣性研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)侵染煙草的 PVY 分離物具有 N 型 HCpro 和 O 型 CP。高芳鑾等[10]在2015年通過全基因組序列和多重 RT-PCR 分析，確定來自中國榆林的馬鈴薯病毒Y(PVY)分離物ShX14 屬于 PVYNTN-NW 株系(SYR-I 型)。蔡偉等[11]于2017年基于系統(tǒng)進(jìn)化和重組分析發(fā)現(xiàn)在田間株系流行中，PVY 重組株系占主導(dǎo)地位。鄒文超等[12]在2017年以PVY的P1、HC-pro、VPg和CP 4個(gè)基因?yàn)檠芯繉ο蠼⒘丝焖贉?zhǔn)確的多基因聯(lián)合體系，通過多基因系統(tǒng)發(fā)育分析證明 HLJ26 分離物屬于 PVYNTN-NW(SYR-II 型)。Bai等[13]在2019年對中國東北馬鈴薯生產(chǎn)區(qū)馬鈴薯Y病毒158個(gè)PVY分離物的分析，發(fā)現(xiàn)PVY有5種重組類型，其中 PVYNTN-NW SYRII 和 PVYN-Wi 是優(yōu)勢種群。Jia 等[14]在2021年對中國山東馬鈴薯Y病毒分離物的遺傳多樣性發(fā)現(xiàn)，侵染山東馬鈴薯的 PVY 以重組型 NTN-NW SYRI 和 SYRII 分離物為主。PVY存在著許多重組株系，目前已發(fā)現(xiàn)超過20余種重組類型，重組株系在多個(gè)國家已成為優(yōu)勢種群[15-20]。【本研究切入點(diǎn)】目前，對青海省主要馬鈴薯病毒種類的發(fā)生情況、分布類型和PVY株系組成信息等方面尚未有系統(tǒng)的報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】明確青海省部分馬鈴薯產(chǎn)區(qū)主要病毒類型及PVY株系類別，為該區(qū)指導(dǎo)馬鈴薯病毒病的防治和品種選育工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2020年8月在大通縣和互助縣采集疑似病株28個(gè)不同品種(系)葉片樣品181份(表1)。采集樣品均保存于-80 ℃超低溫冰箱。

TaKaRa植物RNA提取試劑盒(柱式法)，一步法 RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒(AMV,生工生物)，馬鈴薯病毒ELISA檢測試劑盒(美國Agdia)，ELISA包被緩沖液(生工生物)。

1.2 DAS-ELISA檢測

PVY、PVX、PVM、PVS、PVA、PLRV、AMV、PVYN、PVYC和PVYO+C的ELISA檢測試劑盒均購自美國Agdia公司，檢測方法參照檢測試劑盒說明書。

1.3 分子生物學(xué)檢測

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[13]及GenBank中公布的PVY分離物的外殼蛋白(Coat Protein，CP)基因序列的保守片段，參考董代幸等[21]的方法設(shè)計(jì)PVY檢測引物(表2)，利用該引物對樣品進(jìn)行PCR檢測并測序，引物合成與PCR產(chǎn)物測序均由生工生物完成。

表2 用于本研究的引物

參考TaKaRa植物RNA提取試劑盒說明書提取DAS-ELISA檢測PVY陽性且單獨(dú)侵染馬鈴薯樣品總RNA。參考一步法 RT-PCR 擴(kuò)增試劑盒(AMV)說明書，以總RNA為模板利用引物對樣品進(jìn)行一步法RT-PCR檢測，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳15 min，觀察其條帶并拍照。

1.4 序列分析與同源性比對

PVY序列的比對、核苷酸序列一致率分析和重組分析使用Clustal X、BioEdit軟件和RDP4程序包進(jìn)行。從GenBank中選取已知株系的57個(gè)代表性PVY基因序列(表3)，使用MEGA7軟件中的Clustal W默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行序列比對后，用最大似然法(Maximum Likelihood，ML)對分離物構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[22-24]。

表3 各地的不同來源PVY基因序列

續(xù)表3 Continued table 3

2 結(jié)果與分析

2.1 青海省馬鈴薯主要病毒DAS-ELISA檢測結(jié)果

通過DAS-ELISA方法對28個(gè)品種(系)181份馬鈴薯樣品PVY、PVX、PVS、PVM、PVA、PLRV和AMV病毒帶毒率進(jìn)行檢測(圖1)。8個(gè)馬鈴薯品種(系)32份樣品為PVY血清學(xué)陽性，檢出率為17.68%，11個(gè)馬鈴薯品種(系)35份樣品為PVS血清學(xué)陽性，檢出率19.34%，PVM和PLRV陽性率均為4.42%，未檢出PVX、PVA和AMV。由此可見，PVY和PVS是青海地區(qū)馬鈴薯病毒的主要流行種類。

馬鈴薯病毒單獨(dú)侵染和復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍存在，由表4可知，在DAS-ELISA檢測結(jié)果為陽性的83份病樣中，有56份病樣為單獨(dú)侵染，單一病毒侵染率占67.47%，其中檢測出僅含PVY病樣的有5個(gè)馬鈴薯品種(系)的27份樣品，僅含PVS的病樣有23份，僅含PLRV的病樣有3份，僅含PVM的病樣有2份，PVY單獨(dú)侵染率最高，達(dá)14.92%，其次為PVS，為12.71%。復(fù)合侵染以2種病毒復(fù)合侵染為主，其中，2種病毒復(fù)合侵染PVS+PVM(6份)、 PVY+PVS(3份)和PVS+PLRV(3份)發(fā)生情況較為常見，本次檢測未發(fā)現(xiàn)3種及以上的復(fù)合侵染情況。

2.2 馬鈴薯Y病毒RT-PCR分析

對ELISA檢測Y病毒呈陽性且單獨(dú)侵染的27份陽性樣品分別按相同品種(系)混合，共計(jì)為QH-Y1、QH-Y3、QH-Y12、QH-Y18和QH-Y25 5個(gè)樣品組，通過參考TaKaRa植物RNA提取試劑盒說明書提取馬鈴薯葉片總RNA，在紫外分光光度計(jì)檢測A260/A280下測得的比值分別為2.16、2.19、1.82、2.17、2.00，說明植物組織中的酚類化合物、多糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)抽提充分，總RNA提取結(jié)果良好。利用一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒(AMV)結(jié)合PVY特異性引物PVY-S和PVY-A對樣品進(jìn)行RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)在QH-Y1和QH-Y25樣品組中未能擴(kuò)增到目的條帶，QH-Y3、QH-Y12和QH-Y18樣品組中均能擴(kuò)增出422 bp目的條帶，且QH-Y3和QH-Y18目的條帶明顯，QH-Y12目的條帶較暗(圖2)。說明，QH-Y3和QH-Y18樣品組中馬鈴薯Y病毒RNA含量較多，其次是QH-Y12，而QH-Y1和QH-Y25馬鈴薯Y病毒RNA含量較少。

表4 馬鈴薯病毒單一和復(fù)合侵染率

2.3 馬鈴薯Y病毒株系血清學(xué)檢測

為確保ELISA株系檢測的準(zhǔn)確性，選擇上述DAS-ELIAS檢測PVY單獨(dú)侵染呈陽性且RT-PCR擴(kuò)增到目的條帶的QH-Y3、QH-Y12和QH-Y18 3個(gè)樣品組中的20份分樣進(jìn)行DAS-ELIAS檢測PVYO+C、PVYC和PVYN血清型，結(jié)果如表5和圖3所示。95%的樣品均與PVYO+C呈陽性反應(yīng)，3個(gè)樣品組中均有檢出，其中，QH-Y3樣品組中分樣QH-Y3-1、QH-Y3-5、QH-Y3-7、QH-Y3-8、QH-Y3-10、QH-Y3-11、QH-Y3-12和QH-Y3-13檢測呈陽性，QH-Y12和QH-Y18樣品組中分樣均呈陽性。PVYC和PVYN的陽性率較低，僅QH-Y18-3與PVYC呈陽性反應(yīng)，QH-Y12-2與PVYN呈陽性反應(yīng)。依據(jù)Ellis等[7]在1996年根據(jù)PVY分離物的血清學(xué)特性分組情況，可初步得出，青海省部分地區(qū)馬鈴薯Y病毒株系主集中于PVYO、PVYC、PVYZ、PVYN:O和PVYNTN-NW。

2.4 PVY基因序列一致率及重組分析

為了進(jìn)一步明確青海省部分地區(qū)馬鈴薯Y病毒株系類型，利用引物PVY-S和PVY-A擴(kuò)增DAS-ELIAS檢測PVYO+C、PVYC和PVYN血清型呈陽性的19份樣品PVY序列，產(chǎn)物經(jīng)測序后，使用Clustal X及BioEdit軟件將獲得的19個(gè)PVY的基因序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行兩兩比對。結(jié)果表明，19個(gè)分離物的核苷酸一致率為97.0% ～100%，氨基酸一致率為95.8%～100%。其中，QH-Y12-3和QH-Y3-7之間核苷酸和氨基酸一致率最高，為100%。QH-Y3-5與QH-Y12-2、QH-Y12-6，QH-Y12-2與QH-Y18-1、QH-Y18-5、QH-Y3-1，QH-Y12-6與QH-Y18-1、QH-Y18-5、QH-Y3-1核苷酸和氨基酸一致率最低，分別為97.1%和95.8%(圖4)。利用Clustal X軟件將本研究獲得的19個(gè)PVY分離物以及GenBank中獲得的57個(gè)代表性PVY分離物(表3)進(jìn)行比對分析，隨后通過RDP4.0軟件的重組分析，結(jié)果表明19個(gè)分離物中未發(fā)現(xiàn)重組位點(diǎn)。

表5 PVY各株系ELISA檢測結(jié)果

2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

利用MEGA7軟件將本研究獲得的19個(gè)PVY分離物以及GenBank中獲得的57個(gè)代表性PVY分離物(表3)用軟件中的Clustal W默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行序列比對后，通過最大似然法(Maximum Likelihood，ML)分析本研究獲得PVY分離物進(jìn)化情況。參考Kehoe等[25]的分組結(jié)果，76個(gè)PVY分離物可分為9個(gè)組，分別為PVYN-Wi、PVYO、PVYN:O、PVYN、PVYC、PVYNTN-A、PVYNTN-B、PVYNTN-NW、PVYXIII株系群(圖5)。

PVYN:O株系群中包含了本研究測定樣品中的16個(gè)樣品，分別是QH-Y12-4、QH-Y12-3、QH-Y12-5、QH-Y12-6、QH-Y18-1、QH-Y18-4、QH-Y18-5、QH-Y3-1、QH-Y3-11、QH-Y3-13、QH-Y3-12、QH-Y18-3、QH-Y3-5、QH-Y3-7、QH-Y3-10和QH-Y3-8，占所測樣品的84.21%，這16個(gè)PVY分離物與來自美國的PN10A(登錄號DQ008223)遺傳較近(表3)。另外QH-Y18-2、QH-Y12-2和QH-Y12-1共3個(gè)分離物屬于PVYNTN-NW株系群，占所測樣品的15.79%，其中QH-Y12-2和QH-Y12-1與AB461454相對較近，而QH-Y18-2與GQ200836相對較近。沒有發(fā)現(xiàn)在PVYC、PVYN等株系群的樣品。PVY分離物系統(tǒng)發(fā)育分析與血清學(xué)檢測結(jié)果一致，青海省部分地區(qū)馬鈴薯Y病毒株系類型以PVYN:O、PVYNTN-NW株系為主。青海省內(nèi)不同地域的分離物地域間差異微小，同源性很高，說明PVY的種群基因較穩(wěn)定[26]。

3 討 論

馬鈴薯病毒病是制約我國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一[27]，馬鈴薯病毒病的發(fā)生與攜帶情況是評價(jià)馬鈴薯種薯質(zhì)量優(yōu)劣的重要指標(biāo)，明確不同地區(qū)的病毒種類對有效防控該病害至關(guān)重要。近年來國內(nèi)外已報(bào)道的侵染馬鈴薯的病毒及類病毒超過40種，其中危害我國馬鈴薯比較嚴(yán)重的病毒種類有PVY、PVX、PVS、PVM、PLRV和 PVA[28]。位于青海省東部農(nóng)業(yè)區(qū)的大通縣和互助縣是青海省重要的馬鈴薯繁種基地，對該地區(qū)馬鈴薯病毒檢測結(jié)果顯示，該地區(qū)的病毒種類為PVY、PVM、PVS和PLRV，其中PVY和PVS陽性比率較高，為該區(qū)域馬鈴薯病毒的主要流行種類，且單獨(dú)侵染率高，而復(fù)合侵染以兩種病毒較為常見，發(fā)生復(fù)合侵染的病毒主要為PVS+PVM、PVY+PVS和PVY+PLRV。這與吳興泉等[29]、范國權(quán)等[30]和齊恩芳等[31]對我國黑龍江、內(nèi)蒙古、甘肅、云南等地馬鈴薯病毒病發(fā)生調(diào)查結(jié)果較一致。本研究中PVY和PVS檢出率略低于上述國內(nèi)其它地區(qū)水平，可能與種植區(qū)海拔高度有關(guān)。馬鈴薯種植區(qū)的海拔越高，蚜蟲等傳播介體的活動(dòng)就越受限，病毒增殖速率就越低[32]。本研究中ELISA檢測為陰性又表現(xiàn)出疑似癥狀的樣品，可能由其它病毒或其它原因?qū)е拢枰獙悠愤M(jìn)一步的研究確認(rèn)。以往，學(xué)術(shù)界曾一度把高寒農(nóng)區(qū)，籠統(tǒng)地列定為馬鈴薯病毒病的輕度發(fā)生區(qū)，本研究結(jié)果表明高寒農(nóng)區(qū)馬鈴薯病毒種類多樣，危害較重，對該地區(qū)病毒病防控同樣需要重視。

本研究DAS-ELIAS檢測結(jié)果顯示PVYO+C的陽性率較高，而PVYC和PVYN陽性率較低，依據(jù)Ellis等[7]在1996年根據(jù)PVY分離物的血清學(xué)特性分組情況，推測青海省部分地區(qū)馬鈴薯Y病毒株系存在PVYO、PVYC、PVYZ、PVYN:O和PVYNTN-NW株系的可能，但在PVY株系鑒定上，血清學(xué)方法無法區(qū)分親緣關(guān)系相近或者外殼蛋白相似的病毒[33]，即無法區(qū)分開PVY各種亞株系，如PVYN與PVYNTN、PVYN:O與PVYNTN-NW等[34]，并且在ELISA檢測過程中，由于個(gè)別植物材料可以與抗體發(fā)生非特異性反應(yīng)，產(chǎn)生假陽性干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，為進(jìn)一步明確青海地區(qū)馬鈴薯Y病毒株系類型，對DAS-ELIAS檢測PVYO+C、PVYC和PVYN呈陽性獲得的19份PVY分離物，通過分子生物學(xué)檢測結(jié)合生物信息學(xué)分析得出，16個(gè)PVY分離物與PVYN:O株系親緣關(guān)系較近，3個(gè)PVY分離物PVYNTN-NW株系親緣關(guān)系較近，因此，這16個(gè)PVY分離物可能歸屬于PVYN:O株系，另外3個(gè)PVY分離物歸屬PVYNTN-NW株系，且在不同地域的分離物地域間差異微小，同源性很高，PVY的種群基因較穩(wěn)定，該結(jié)果與DAS-ELIAS檢測PVYO+C、PVYC和PVYN結(jié)果較為吻合，且PVYN:O、PVYNTN-NW株系在青海尚屬首次報(bào)道。本研究采用DAS-ELIAS檢測PVYO+C、PVYC和PVYN結(jié)合分子生物學(xué)及生物信息學(xué)方法對青海省部分地區(qū)的馬鈴薯病毒病種類和PVY流行株系進(jìn)行了系統(tǒng)的檢測分析，對本地區(qū)的馬鈴薯病毒病的防治和品種選育工作具有一定的指導(dǎo)意義。

4 結(jié) 論

本研究對青海省部分地區(qū)疑似病毒癥狀的馬鈴薯樣品進(jìn)行了7種主要病毒種類的檢測，并對Y病毒株系類型進(jìn)行了分析。明確了青海省部分地區(qū)的馬鈴薯病毒為PVY、PVS、PVM和PLRV 4個(gè)種類，且PVY和PVS單獨(dú)侵染較高，復(fù)合侵染中以兩種病毒復(fù)合侵染為主，其中PVS+PVM、 PVY+PVS和PVS+PLRV發(fā)生情況較為常見。馬鈴薯Y病毒株系類型以PVYN:O和PVYNTN-NW株系為主，不同區(qū)域的PVY病毒的核苷酸和氨基酸一致率高，未發(fā)現(xiàn)基因重組位點(diǎn)，種群基因較穩(wěn)定。