高志鵬，馮 霞，杜玉簫，李亞男，陳大清

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院農(nóng)業(yè)與生物學院，廣州 510225；2.長江大學生命科學學院，湖北 荊州 434025；3.長江大學發(fā)展規(guī)劃處，湖北 荊州 434023)

【研究意義】硒是人體必需的微量元素，具有抗氧化和抗衰老功能[1]。同時，適量的硒可以促進植物生長發(fā)育、新陳代謝、增強抗氧化活性、提高作物品質(zhì)[2]。油菜是重要的油料作物，對其油脂和蛋白品質(zhì)進行改良是開展油菜分子育種的重要環(huán)節(jié)。近年來，油菜轉基因技術得到了迅速發(fā)展，將油菜作為富硒生物資源進行開發(fā)對豐富人類生物有機硒源具有重要意義[3]。在非聚硒植物體中，硒毒性主要是通過以硒代氨基酸的形式參與蛋白質(zhì)的合成[4]，導致蛋白質(zhì)結構和功能發(fā)生改變而產(chǎn)生毒害作用，降低植物的硒耐受性。植物是否耐硒主要取決于植物的硒代謝能力[5]，因此，可將提高油菜體內(nèi)硒代謝能力作為培育富硒油菜品種的重要途徑。植物體硒代謝途徑包含多種生物酶類，而AtCpNifS蛋白同時具有半胱氨酸脫硫酶活性和硒代半胱氨酸裂解酶活性，且對硒代半胱氨酸具有偏好性，能夠催化硒代半胱氨酸分解生成丙氨酸和硒[6]。因此，構建AtCpNifS轉基因油菜，研究其在硒酸鈉脅迫下的響應模式，對于推動富硒油菜品種的選育工作具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】在擬南芥中發(fā)現(xiàn)一種葉綠體蛋白(AtCpNifS)，其是一種二聚體形式的PLP依賴酶，其蛋白質(zhì)序列與NifS基因編碼的半胱氨酸脫硫酶序列具有同源性。AtCpNifS基因的超表達顯著提高擬南芥對硒的耐受性以及積累能力，其根生長比對照提高了1.9倍，硒在地上部的積累量提高了2～3倍[7]。AtCpNifS基因的超表達可以顯著降低硒與蛋白質(zhì)的結合程度，同時提高植物體內(nèi)硫元素的積累量?；蛐酒治鼋Y果表明：在硒酸鹽處理下，超表達AtCpNifS基因植株和非轉基因植株之間存在部分轉錄本差異，超表達植株的AtCpNifS表達水平相較于對照組中的非轉基因植株提高了27～40倍[7]。AtCpNifS基因超表達下硒累積量的增加和硒耐受性的增強揭示了其在富硒品種改良中的潛在價值。Garifullina等[8]發(fā)現(xiàn)，轉基因印度芥菜(Brassicajuncea)的硒代半胱氨酸裂解酶活性是非轉基因植株的6倍，苗期植株地上部的硒含量顯著上升，但是植株的硒耐受性明顯下降，推測可能是硒干擾了葉綠體中的硫代謝。Pilon等[9]將硒代半胱氨酸裂解酶基因轉入擬南芥中表達，發(fā)現(xiàn)硒代半胱氨酸裂解酶基因表達于細胞質(zhì)的植株的酶活性和硒耐受性顯著增強。表明運用轉基因技術增強植物硒代謝能力和提高耐硒性是可行的?！颈狙芯壳腥朦c】甘藍型細胞質(zhì)雜交油菜品種蜀雜9號的芥酸是0.02%, 硫甙23.03 μmol/g, 含油率41.47%[10]，具有高產(chǎn)“雙低”的優(yōu)良品質(zhì)，是具有開發(fā)價值的富硒生物資源。目前，關于該油菜品種的轉基因研究鮮有報道，關于利用AtCpNifS基因提高油菜硒耐受性的研究也鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】利用農(nóng)桿菌介導法構建轉AtCpNifS基因蜀雜9號油菜植株，運用PCR檢測以及GUS組織化學染色進行表達驗證。同時，比較硒酸鈉脅迫下轉基因植株和非轉基因植株的谷胱甘肽過氧化物酶活性以及AtCpNifS基因表達水平，為進一步研究AtCpNifS基因在提高油菜的硒耐受性作用機制和定向選育富硒油菜品種提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的蜀雜9號油菜(BrassicanapusL.)、野生型擬南芥(ArabidopsisthalialaL.)、大腸桿菌 DH5α、農(nóng)桿菌 GV3101、質(zhì)粒 pBI121以及其他生化試劑均由長江大學生命科學學院重點實驗室提供。柱式小量植物總RNA抽提試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司；Prime ScriptTMIV 1st strand cDNA Synthesis Mix購自寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司；X-Gluc購自銘銳生物有限公司；吲哚乙酸(IAA)、奈乙酸(NAA)、6-芐胺基嘌呤(6-BA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、硝酸銀(AgNO3)、乙酰丁香酮(AS)、羧芐青霉素(Cb)、卡那霉素(Kan)、頭孢霉素(Cef)、利福平(Rif)、硫酸鏈霉素(Str)購自武漢天源生物有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物材料培育 取籽粒飽滿的油菜種子浸泡于0.1% Triton中2～3 min，用無菌水清洗一次并置于NaClO(1∶8)中浸泡8～10 min。取出種子并用無菌水清洗4～5次后接種于MS固體培養(yǎng)基中進行無菌苗繁殖。

挑選籽粒飽滿的擬南芥種子，播種在蛭石培養(yǎng)盤中，發(fā)芽后施1/2的MS培養(yǎng)液，置人工氣候箱中(25 ℃)，每天光照16 h條件下培養(yǎng)。

1.2.2 擬南芥總RNA提取與cDNA合成 選取2周齡的擬南芥幼苗根據(jù)上海華舜生物技術有限公司的柱式小量植物總RNA抽提試劑盒的說明進行總RNA的提取，cDNA的合成則根據(jù)寶日醫(yī)生物技術(北京)有限公司的Prime ScriptTMIV 1st strand cDNA Synthesis Mix說明進行操作。

1.2.3AtCpNifS基因克隆及植物表達載體構建 基于擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.arabidopsis.org/)AtCpNifS基因(登錄號：At1g08490)的CDS序列，利用Primer Premier 5.0設計CDS擴增引物CDS-F/CDS-R(表1)，并在Oligo 6.0上驗證，以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，57～59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。用XbaI、BamH I分別酶切AtCpNifS擴增片段和pBI121質(zhì)粒并用T4連接酶連接，構建表達載體pBI121-AtCpNifS(圖1)并轉化大腸桿菌DH5α中，轉化后的大腸桿菌 DH5α接種于含有氨芐青霉素(50 μg/mL)LB培養(yǎng)基中進行陽性克隆篩選。挑選陽性克隆接種培養(yǎng)經(jīng)雙酶切鑒定后，于15%甘油保存，取1 mL菌液置1.5 mL離心管中送上海生物工程有限公司進行測序。

表1 引物信息

1.2.4 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備 挑取農(nóng)桿菌單菌落接種于5 mL含Rif的YEB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，160～250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。YEB培養(yǎng)基成分見表2。取2 mL菌液轉入50 mL YEB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD值為0.3～0.5。轉入無菌離心管，冰浴10 min。4000 r/min離心10 min，去上清。加入40 mL 50 mmol/L CaCl2重懸菌液，離心10 min，去上清。5 mL預冷的50 mmol/L CaCl2懸浮細胞，冰浴并分裝成每管200 μL。

1.2.5 植物表達載體向農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉化 取200 μL感受態(tài)細胞，加入20 μL構建好的質(zhì)粒載體，冰上放置10～20 min，液氮中速凍2 min，28 ℃水浴5 min，然后加入1 mL YEB培養(yǎng)基，28 ℃慢速振蕩培養(yǎng)4 h；涂布于含有100 mg/mL Kan、40 mg/mL Rif和125 mg/mL Str的YEB平板上，28 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.6 農(nóng)桿菌介導的油菜遺傳轉化 將含有植物表達載體的農(nóng)桿菌接種于YEB液體培養(yǎng)液(含有50 mg/mL Kan、40 mg/mL Rif和125 mg/mL Str)中，28 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.3～0.8；4000 r/min室溫離心10 min，用含有100 mg/L AS的MS鹽溶液(pH 7.0)重新懸浮菌體調(diào)整至菌液濃度為OD600=0.5。

將油菜外植體浸入上述菌液1 min，期間不斷振蕩使菌液與外植體充分接觸。用無菌濾紙迅速吸干多余菌液，將外植體移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基(表3)上，黑暗環(huán)境下共培養(yǎng)2 d。共培養(yǎng)后的外植體轉移到愈傷誘導培養(yǎng)基中，于24～26 ℃每天光照16 h的培養(yǎng)箱中進行選擇培養(yǎng)7 d。篩選抗性的愈傷組織轉入分化培養(yǎng)基上進行分化誘導,分化出的再生苗移植到生根培養(yǎng)基中誘導不定根的產(chǎn)生。待生根后，于MS培養(yǎng)基中進行轉化苗的大量繁殖。根據(jù)表達載體pBI121-AtCpNifS的序列信息，利用Primer Premier 5.0設計檢測引物D-AtCpNifS-F/D-AtCpNifS-R(表1)并挑選轉化苗進行PCR檢測。

表2 YEB 培養(yǎng)基成分

表3 油菜遺傳轉化培養(yǎng)基

1.2.7 GUS組織化學染色 室溫下，將植物材料放置于50%丙酮溶液中，浸泡30 min。取出材料，用雙蒸水沖洗一次，然后用磷酸緩沖液(pH 7.0)沖洗3次。在染色液中37 ℃浸泡24 h。將浸染過的試材轉入脫色液中50 ℃水浴脫色，至陰性對照材料呈白色為止，觀察GUS基因表達情況。

1.2.8AtCpNifS基因的半定量RT-PCR分析 采用含有0、10、20 mg/L的硒酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)轉基因油菜和非轉基因油菜，4周后分別采集不同濃度硒鹽培養(yǎng)的植株葉片進行總RNA的提取與cDNA鏈的合成。利用Primer Premier 5.0設計AtCpNifS和Actin的特異性引物AtCpNifS-F/AtCpNifS-R和Actin-F/Actin-R(表1)，分別對目的基因AtCpNifS和內(nèi)參基因Actin進行擴增。PCR擴增程序為95 ℃，4 min；94 ℃，1 min，56 ℃，1.5 min，72 ℃，2min，30個循環(huán)；72 ℃，10 min。反應結束后，取5 μL擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.9 谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的酶活性測定 分別選取經(jīng)過0、10、20 mg/L的硒酸鈉處理2周和4周的轉基因油菜植株和非轉基因油菜植株的葉片0.5 g，參考GPX酶活力測定間接法進行油菜的GPX酶活力測定[11]，應用SPSS和Excel進行統(tǒng)計學分析。

2 結果與分析

2.1 AtCpNifS基因的克隆及植物表達載體的構建

從圖2可以清晰觀察到28S rRNA和18S rRNA2條明亮的條帶，5S rRNA條帶也可以看見，說明提取的RNA降解較少，質(zhì)量較高，可用于合成cDNA。使用AtCpNifS基因的CDS引物以cDNA為模板，擴增出1400 bp左右的特異性條帶(圖3)，與預計的AtCpNifS基因cDNA編碼區(qū)序列大小相符，說明已初步擴增出了南芥中的AtCpNifS基因cDNA序列。挑取陽性單菌落搖菌培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板進行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物電泳可見大小約1400 bp的特異性條帶(圖4)，與預期大小一致。對PCR為陽性的質(zhì)粒用XbaI和BamH I雙酶切鑒定，電泳結果可見兩條大小約14 kb的質(zhì)粒條帶和1400 bp的目的條帶(圖5)，證明pBI121-AtCpNifS構建成功。將經(jīng)鑒定含有目的片段的表達載體進行DNA測序比對，比對結果顯示測序序列與目的基因序列高度相似，說明AtCpNifS基因克隆成功，表達載體pBI121-AtCpNifS成功構建。

2.2 農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞的轉化

選取經(jīng)測序確定正確的pBI121-AtCpNifS重組質(zhì)粒經(jīng)凍融法轉化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，從轉化平板上挑取陽性單菌落提取質(zhì)粒進行PCR鑒定，PCR產(chǎn)物可見與表達載體pBI121-AtCpNifS擴增大小相同的特異條帶，約為1400 bp(圖6)，證明pBI121-AtCpNifS重組質(zhì)粒成功轉入農(nóng)桿菌GV3101。

2.3 轉基因油菜植株的表達鑒定

用CTAB法提取轉基因植株的DNA，以非轉基因油菜植株為陰性對照，陽性轉化農(nóng)桿菌為陽性對照，利用檢測引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，轉基因植株可以擴增出與陽性質(zhì)粒大小一樣的特異性條帶(圖7)，證明成功構建了轉AtCpNifS基因油菜。經(jīng)過GUS染色后，在陰性對照材料沒有觀察到藍色斑點，在轉基因油菜中可以觀察到清晰的藍色GUS表達位點(圖8)。說明AtCpNifS基因成功轉化并且在植株中表達。

2.4 AtCpNifS基因的半定量RT-PCR分析

因為油菜Actin基因以及AtCpNifS基因大約32個循環(huán)后便開始進入平臺期，所以確定擴增循環(huán)數(shù)為30，PCR結果如圖9所示。轉基因植株在0～20 mg/L硒酸鈉濃度范圍內(nèi)表達量呈上升趨勢(圖10)，轉基因油菜的相對表達量在沒有硒酸鈉處理時為0.755，在20 mg/L的硒酸鈉處理時為1.545，增加了2.05倍。

2.5 谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性分析

用硒酸鈉處理油菜2周時，非轉基因植株葉片在沒有硒酸鈉處理時的GPX活性為231.48 μmol/(g FW·min)，在10 mg/L硒酸鈉濃度下為218.97 μmol/(g FW·min)，兩者差異不顯著，而在20 mg/L處理濃度時，GPX活性為294.06 μmol/(g FW·min)，比低濃度時的活性有明顯升高(圖11)，說明硒酸鈉脅迫已顯著誘導油菜葉片GPX活性上調(diào)。轉基因植株葉片的GPX活性隨著硒酸鈉的濃度升高而升高且活性均大于同期的非轉基因植株，說明轉基因植株比非轉基因植株具有更高的硒脅迫敏感性和更快的調(diào)節(jié)能力。用硒酸鈉處理油菜4周時，轉基因植株和非轉基因植株均比處理2周時酶活力值增加，說明隨著處理時間的延長，硒酸鈉脅迫壓力逐漸增大，從而引起了GPX活性的升高(圖12)。轉基因油菜葉片在用20 mg/L硒酸鈉處理4周時有最大酶活力值380.18 μmol/(g FW·min)，相應的非轉基因油菜酶活力值為329.93 μmol/(g FW·min)，差異顯著。

3 討 論

在遭受逆境脅迫時，植物細胞內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，破壞細胞氧化還原平衡，造成氧化脅迫[12-14]。谷胱甘肽化物酶(GPX)是一種酶促抗氧化劑[15-16]，屬于植物酶促抗氧化系統(tǒng)成員，在植物細胞抵抗氧化脅迫過程發(fā)揮重要作用[17]。當植物遭受重金屬、干旱等脅迫時[18]，多數(shù)GPX的表達以及活性會顯著增強。前人研究發(fā)現(xiàn)，GPX除具備清除活性氧的作用外，還能作為氧化還原轉導子參與細胞氧化還原信號轉導[19]，以及通過與磷脂酶ABI1/ABI2互作，激活離子通道[20-21]，轉導細胞信號以提升植物對于脅迫信號的響應，進而提高植物的脅迫耐受性。硒元素能夠顯著影響高等植物的GPX活性，在一定硒濃度范圍內(nèi)，硒對該酶活性增加有明顯的促進作用，超過一定硒濃度則酶活力下降，而且植物生長也受到抑制，這種現(xiàn)象可能與硒的毒害有關[22]。因此本研究選取GPX作為油菜響應硒酸鈉脅迫的生化指標，研究結果表明，油菜在硒酸鈉脅迫下，GPX活性隨著硒酸鈉濃度升高而升高，隨著處理時間增加而增加。且實驗結果表明轉AtCpNifS基因油菜對于硒酸鈉脅迫的響應更加迅速，谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著高于同期處理的非轉基因油菜。證明轉AtCpNifS基因油菜的谷胱甘肽過氧化酶的抗氧化能力得到了加強，同時推測其對于硒酸鈉脅迫的耐受性也會隨著GPX蛋白參與調(diào)節(jié)相應的細胞信號轉導而增加。但具體的信號通路調(diào)節(jié)機制尚不清楚。此外，Bax蛋白是細胞凋亡的誘導因子，其特異性表達和過氧化氫的積累以及熱激誘導都能導致酵母細胞死亡，在植物細胞中Bax的特異性表達能夠?qū)е陆M織塌陷，破壞細胞膜的完整性及通透性，從而導致植物細胞凋亡[23]。Chen等[24]發(fā)現(xiàn)番茄中的磷脂氫谷胱甘肽過氧化物酶LePHGPX在煙草中瞬時表達能夠抑制在鹽、熱激脅迫下細胞凋亡特征的產(chǎn)生，同時能夠拮抗Bax表達導致的細胞死亡效應。GPX與LePHGPX具有同源性，因此推測GPX可能通過拮抗硒脅迫下細胞凋亡的發(fā)生，以增強其耐受性。

酶是細胞代謝過程中重要的組成部分，AtCpNifS因其同時具備半胱氨酸脫硫酶活性和硒代半胱氨酸裂解酶活性[25]，而在硒代謝研究中備受關注。本研究中的半定量RT-PCR結果表明，在硒酸鈉脅迫下，AtCpNifS基因的表達量隨著硒酸鈉濃度的增加而顯著升高。在非轉基因油菜中并沒有發(fā)現(xiàn)AtCpNifS基因的表達。說明該基因?qū)τ谖徕c脅迫具有靈敏的響應，推測可能是通過加快硒代半胱氨酸的代謝，從而減少了硒代半胱氨酸摻入蛋白質(zhì)，提升油菜對于硒脅迫的耐受性[26]。此外，因為硒酸鹽與硫酸鹽的化學性質(zhì)相似，植物體內(nèi)硒和硫的同化存在競爭關系[27]。前人研究發(fā)現(xiàn)AtCpNifS的轉基因植株中硫元素的水平顯著升高。所以推測AtCpNifS除了可以通過裂解硒代半胱氨酸外，還可以通過提高植物體內(nèi)硫元素的水平，加強與硒元素的競爭，從而減少硒化物的形成，提高植物的硒耐受性。

4 結 論

本研究成功構建轉AtCpNifS基因蜀雜9號油菜，其在硒酸鈉脅迫下的谷胱甘肽過氧化物酶活性顯著增強，同時AtCpNifS基因表達量也在硒酸鈉脅迫下上調(diào)。推測AtCpNifS基因在蜀雜9號油菜的硒耐受性提升中發(fā)揮作用。