蔡冬冬,張 輝,王正義,羅 毅,劉伽均,李 春,胡曉亮,田志革*
(1.四川省動物疫病預(yù)防控制中心,四川 成都 610041;2.宜賓學(xué)院農(nóng)林與食品工程學(xué)部,動物多樣性與生態(tài)保育宜賓市重點(diǎn)實驗室,四川 宜賓 644000)
1.1 細(xì)胞、毒株和質(zhì)粒 FIPV DF2株、仙臺病毒(Sendai virus,SeV)、螢火蟲熒光素酶報告質(zhì)粒、轉(zhuǎn)錄因子PRDⅢ/Ⅰ、NF-κB 和AP-1 報告質(zhì)粒、RIG-1、MAVS、STING和TBK-1,均由中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供;CRFK細(xì)胞、空載體質(zhì)粒p3×flag和pUb由“動物多樣性與生態(tài)保育宜賓市重點(diǎn)實驗室”保存;大腸桿菌感受態(tài)Trans5α購自寶生物工程(大連)有限公司。
1.2 主要試劑 鼠抗flag 單抗、兔抗GAPDH 單抗、抗IRF3-S396、抗IRF3 抗體,均購于Sigma 公司;質(zhì)粒提取試劑盒,購于AXYGEN公司;膠回收純化試劑盒,購于OMEGA 公司;雙熒光素酶報告系統(tǒng)試劑盒,購自Promega 公司;DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基,購于Hyclone 公司;胎牛血清,購自Hyclone公司;胰酶,購于Gibco BRL公司;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑,購于Invitrogen 公司;Tween-20、30%聚丙烯酰胺等試劑,購于索萊寶公司;PVDF 膜,購自Millipore 公司;RAPI 裂解液,購自碧云天公司。
1.3 FIPV PL1 基因的PCR 擴(kuò)增 根據(jù)FIPV DF2 株(GenBank 登錄號:JQ408981)的PL1 基因(3566-4355位點(diǎn)),使用Oligo軟件設(shè)計1對引物,上游引物:5′-TTTAAGCTTTCCTTGACCCCATTCA AGACA-3′,下游引物:5′-TTTGAATTCTTAATCT TTAGGACTTTGACAGTC-3′,預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度為792 bp。
1.4 PL1 蛋白抑制宿主細(xì)胞產(chǎn)生IFN-β的機(jī)制研究 轉(zhuǎn)染前一天,將CRFK 細(xì)胞均勻鋪于24孔板中,待細(xì)胞長成單層且密度達(dá)到80%左右進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系中有1 μg PL1及其突變體質(zhì)粒,300 μL DMEM 無血清培養(yǎng)液,3 μL 轉(zhuǎn)染試劑,10 ng RL-TK 內(nèi)參質(zhì)粒。依據(jù)試驗?zāi)康?,分別另向體系中加入600 ng IFN-β-Luc、NF-κB-Luc、PRD Ⅲ/Ⅰ-Luc或AP-1-luc報告質(zhì)粒,每個試驗重復(fù)3次,同時設(shè)置空載體對照。轉(zhuǎn)染24 h后,每孔加入100 HAU的SeV,12 h后棄去上清,用裂解液將細(xì)胞裂解10 min,8 000 r/min 離心5 min 后取20 μL裂解液進(jìn)行熒光素酶活性測定。
1.5 激光共聚焦試驗 將293T細(xì)胞接種到激光共聚焦小皿中培養(yǎng)過夜。將PL1 蛋白與空載體p-flag 共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24 h 后,棄培養(yǎng)基,PBS洗滌2次后,用4%多聚甲醛室溫固定30 min,并用0.1% TritonX-100 透膜15 min,用5%脫脂乳封閉1 h 后,加入抗IRF3 和抗IRF3-S396 抗體(1∶1 000)稀釋,37 ℃孵育1 h,用PBS洗滌3次,分別加入抗兔和抗人抗體作為二抗,在37℃孵育1h,隨后用PBS 洗滌3 次,DAPI 染色15 min,洗滌3次,最后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。
1.6 免疫印跡試驗 將PL1 蛋白與p-flag 載體分別與pUb 載體共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞后,接種SeV(100 HAU)12 h 后,收集細(xì)胞裂解液,經(jīng)過13 000 r/min離心5 min后取上清,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,37 ℃封閉2 h,分別加入抗IRF3、抗IRF3-S396 抗體(1∶1 000)和HA 抗體(1∶3 000)后,加入抗兔和抗人抗體作為二抗,進(jìn)行免疫印跡檢測。
2.1 PL1 蛋白抑制IFN-β啟動子活性 為驗證PL1 蛋白能否抑制IFN-β啟動子的激活,將PL1與IFN-β啟動子共轉(zhuǎn)染CRFK 細(xì)胞,結(jié)果顯示PL1 能夠抑制SeV 誘導(dǎo)的INF-β啟動子的激活(圖1-A)。但是INF-β啟動子含有3種轉(zhuǎn)錄因子PRDⅢ/Ⅰ、NF-κB 和AP-1,為進(jìn)一步確定PL1 蛋白抑制哪一種轉(zhuǎn)錄因子,將PL1 蛋白與3 種轉(zhuǎn)錄因子啟動子載體共轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染24 h后加入SeV,采用上述方法處理細(xì)胞后,檢測熒光素酶強(qiáng)度。結(jié)果表明PL1蛋白能夠抑制全部3種轉(zhuǎn)錄因子并且呈劑量依賴性(圖1-B、C、D)。說明PL1 蛋白具有抑制IFN-β啟動子的能力,并且能夠抑制3 種轉(zhuǎn)錄因子啟動子的活性。
圖1 PL1蛋白抑制IFN-β啟動子活性
2.2 PL1 蛋白抑制IRF3 磷酸化 為了驗證PL1是否影響IRF3的磷酸化,將PL1轉(zhuǎn)染293T后,分別接種SeV(HA=100),24 h 后分別進(jìn)行Western blotting實驗檢測,結(jié)果與SeV誘導(dǎo)后相比,PL1蛋白能夠明顯下調(diào)IRF3的磷酸化(圖2)。
圖2 PL1抑制IRF3磷酸化
2.3 PL1 依賴催化活性抑制IFN-β的表達(dá) 為了確定PL1介導(dǎo)的抑制IFN-β表達(dá)是否依賴其催化活性,將PL1 突變體(C32A、H183A 和D196A)與RIG-1、MAVS、STING和TBK-1、IFN-β-Luc和pRL-TK 共轉(zhuǎn)染293T 后,接種SeV,24 h 后檢測Luciferase值。結(jié)果表明:與PL1相比,PL1的突變體(C32A 和H183A)幾乎完全喪失對抗IFN-β啟動子活性的能力,而D196A 僅僅有部分抑制活性?;诖耍覀兇_認(rèn)PL1蛋白抑制IFN-β啟動子的活性需要被催化。PL1 能夠分別抑制RIG-1、MAVS、STING 和TBK-1 誘導(dǎo)的IFN-β 的激活(圖3)。
圖3 FIPV PL1突變體與IFN-β-Luc的關(guān)系
2.4 PL1 利用DUB 活性降低Ub 的泛素化 上述試驗證明PL1 蛋白能抑制IFN-β啟動子活性,而PL1 突變體不具有其活性,PL1 的催化活性區(qū)域負(fù)責(zé)蛋白的去泛素化,這說明PL1 蛋白可能依賴于其蛋白酶活性。我們通過Western blotting實驗證明PL1 蛋白具有去泛素化活性,而PL1 的突變體并不存在去泛素化活性(圖4)。
圖4 PL1蛋白的去泛素化活性
CoV-NL63 的PL 和SARS-CoV 的PL 既能通過抑制IRF-3 的磷酸化和核轉(zhuǎn)移阻斷IFN 的合成,又能抑制STING 介導(dǎo)的IFN-3 的核轉(zhuǎn)移[1]。細(xì)胞中表達(dá)野生型和催化突變PL2-TM能夠降低STING、RIG-1、TBK-1和IRF-3的泛素化水平,這些都可能影響IFN誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。MHV的PL2明顯抑制CARDIF、TBK-1和IRF-3介導(dǎo)的IFN-β啟動子激活,還能與IRF-3 結(jié)合抑制其核轉(zhuǎn)移利用其去泛素化活性[2]。PEDV 的PL2 和TGEV 的PL1作為病毒的去泛素化酶干擾RIG-1和STING介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。冠狀病毒利用PL 的酶活性逃避宿主固有免疫抗病毒反應(yīng)。FIPV PL1 具有與TGEV PL1 相似的結(jié)構(gòu),后者具有去泛素化酶活性,因此推測FIPV PL1 也可能有此活性和功能。本研究發(fā)現(xiàn)FIPV PL1 抑制IFN-β啟動子的表達(dá)和IRF-3的移核通過其催化活性區(qū)。
泛素化和去泛素化是病毒誘導(dǎo)的Ⅰ型IFN信號通路的重要調(diào)節(jié)方式[4]。RIG-1 通過E3 泛素化連接酶(TRIM25),引起下游Ⅰ型IFNs 的信號表達(dá)盒[5]。很多病毒具有去泛素化酶活性,比如口蹄疫病毒的Lpro[6],人巨細(xì)胞病毒的UL48[7],單純皰疹病毒的UL36[8]和豬繁殖與呼吸合征病毒的nsp2 蛋白[9]。所有的冠狀病毒都編碼去泛素化酶,這可能會調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)FIPV PL1 的3 個催化活性中心的突變能夠使去泛素化作用失活,不能抑制病毒誘導(dǎo)的IFN-β的激活,說明FIPV PL1 的去泛素化作用直接涉及Ⅰ型干擾素的抑制作用。