李傳浩，唐偉，王鶴鳴，周強(qiáng)

（安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 合肥 230601）

0 引言

間質(zhì)性肺疾病（ILD）亦稱間質(zhì)性肺炎，是一組主要累積肺間質(zhì)和肺泡腔，導(dǎo)致肺泡- 毛細(xì)血管功能單位喪失的彌漫性肺疾病。ILD 可最終發(fā)展為彌漫性肺纖維化和蜂窩肺，導(dǎo)致呼吸衰竭而死亡[1]。ILD 目前主要通過(guò)臨床癥狀如咳嗽、胸悶、通氣、擴(kuò)散功能障礙和限制性通氣功能障礙和肺功能測(cè)試以及高分辨率CT（HRCT）進(jìn)行聯(lián)合診斷[2-3]。然而，ILD 患者在出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)，其肺部結(jié)構(gòu)也會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的改變。因此早期診斷不僅有助于更好地確定治療方案，而且有助于改善其預(yù)后。

高遷移率組框蛋白1（HMGB-1）是一種多功能細(xì)胞因子，通過(guò)與特定細(xì)胞表面受體結(jié)合，參與感染、炎癥、凋亡和免疫反應(yīng)的基本過(guò)程[4-6]。更重要的是，HMGB-1 可能參與纖維化疾病，包括肺纖維化[7]。

人組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白（Kallistatin）是一種血漿蛋白和一種新型的組織激肽釋放酶抑制劑[8]。Kallistatin 有多種功能，具有抗血管生成、凋亡、炎癥和氧化應(yīng)激的活性[9-10]。有研究表明，Kallistatin 通過(guò)抑制血管生成和炎癥進(jìn)而抑制肺纖維化進(jìn)程[11]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021 年4 月1 日至2021 年7 月31 日在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診確診的ILD 患者54 例，參考美國(guó)呼吸協(xié)會(huì)/歐洲呼吸協(xié)會(huì)制定的分類標(biāo)準(zhǔn)[12]，ILD 通過(guò)臨床癥狀及典型HRCT 表現(xiàn)診斷，排除標(biāo)準(zhǔn)為惡性腫瘤、慢性阻塞性肺疾病、重癥肺炎、肝腎疾病。選取同期在醫(yī)院體檢中心體檢的健康人群40 例。本研究經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

血清Kallistatin ELISA 試劑盒（E-EL-H5550c）及HMGB-1 ELISA 試 劑 盒（E-EL-H1554c）均來(lái)自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司（Elabscience），酶標(biāo)儀采用KHB 科華生物酶標(biāo)儀ST-360 型。

1.3 方法

1）收集患者及健康人群空腹全血，并以室溫下4000 r/min 離 心5 min 制 備 血 清，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?）收集研究對(duì)象的基礎(chǔ)資料：性別、年齡；3）檢測(cè)血液常規(guī)指標(biāo)：白細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)（White blood cell counts,WBC）、中性粒細(xì)胞絕對(duì) 計(jì) 數(shù)（Absolute neutrophil count，ANC）、單 核細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)（Absolute monocyte count，AMC）、淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)（Absolute lymphocyte count，ALC）、血小板計(jì)數(shù)（Platelet，PLT）、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞（Neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）、單核細(xì)胞/ 淋巴細(xì)胞（Monocyte-to-lymphocyte ratio,MLR）、血 小 板/ 淋 巴 細(xì) 胞（Platelet-tolymphocyte ratio，PLR）；4） 血 清Kallistatin 及HMGB-1 水平分別采用Kallistatin 檢測(cè)試劑盒及HMGB-1 檢測(cè)試劑盒通過(guò)ELISA 法定量檢測(cè)，并在450 nm 處用酶標(biāo)儀測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)品及樣品吸光度（OD），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；5）檢測(cè)ILD 患者肺功能相關(guān)指標(biāo)：肺總量（Total lung volume,TLC）、一氧化碳彌散量（diffusing capacity of lungs for carbon monoxide,DLCO）實(shí)預(yù)比、用力肺活量（Forced vital capacity,FVC）實(shí)預(yù)比、第1 秒用力呼氣容積（Forced expiratory volume in one second, FEV1）實(shí)預(yù)比、肺活量（vital capacity，VC）。

1.4 ILD 的分期系統(tǒng)和疾病嚴(yán)重程度評(píng)估

目前ILD 的分期系統(tǒng)和疾病嚴(yán)重程度主要采用綜合生理指數(shù)（Composite physiologic，CPI）和ILD-GAP 評(píng) 分[13]。CPI= 91-（0.65×DLCO預(yù)測(cè)值百分比）-（0.53×FVC 預(yù)測(cè)值百分比）+（0.34×FEV1預(yù)測(cè)值百分比）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。連續(xù)變量若符合正態(tài)分布則用±s 表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，若不符合正態(tài)分布則用P50（P25,P75）表示，采用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，P＜0.05 被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)構(gòu)建ROC 曲線比較Kallistatin 及HMGB-1 的診斷效能，并用Z 檢驗(yàn)比較不同ROC曲線下面積（AUC）。采用Pearson 相關(guān)性分析比較Kallistatin 及HMGB-1 水平與ILD 嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 ILD 患者和健康對(duì)照組的臨床特征

54 例ILD 患者和40 例健康對(duì)照者的人口學(xué)和臨床特征見(jiàn)表1。ILD 患者男和健康對(duì)照組在性別、年齡、WBC、AMC、PLT 等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而兩組間在NLR[3.18（1.89,4.58）vs1.72（1.30,2.10）]、MLR[0.32（0.24,0.42）vs0.22（0.17,0.26）]、PLR[134.66（95.78,205.74）vs 96.04（78.87,131.27）]方面差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 ILD 患者及健康對(duì)照組臨床特征

2.2 ILD 患者肺功能特征

在54 例ILD 患者中有33 例患者進(jìn)行肺功能實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)患者的肺功能相關(guān)指標(biāo)如表2，患 者VC 平 均 值 為76.72%±19.11%、FVC平 均 值 為78.60%±19.90%、TLC 平 均 值 為79.00%±29.27%、FEV1 平均值為（79.56±19.40）、MEF25 平均值為（64.40±32.99）、MEF50 平均值為（77.68±24.50、DLCO 平均值為（66.37±23.43），均小于正常值。RV/TLC 平均值為（51.63±13.24），大于正常值。在33 例行肺功能檢測(cè)的患者中，有20 例患者FVC 占預(yù)計(jì)值%＜80%（60.6%），26 例患者DLCO 占預(yù)計(jì)值%＜80%（78.8%）。

表2 ILD 患者的肺功能指標(biāo)

2.3 ILD 患者與健康對(duì)照組的血清Kallistatin 及HMGB-1 表達(dá)水平

根據(jù)ELISA 結(jié)果顯示，ILD 患者血清Kallistatin水平[3.44（2.20-6.28）] 高于健康對(duì)照組[2.29（1.39-3.28）]，ILD 患者血清HMGB-1 水平[19.31（6.78,43.99）]顯著高于健康對(duì)照組[6.9（34.65,10.06）]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），如圖1。

圖1 ILD 患者與健康對(duì)照組的血清Kallistatin 及HMGB-1表達(dá)水平

2.4 血清Kallistatin 水平及血清HMGB-1 水平對(duì)ILD 的診斷效能

以健康體檢者為對(duì)照組繪制ROC 曲線，評(píng)估血清Kallistatin 水平及血清HMGB-1 水平單獨(dú)用于診斷ILD 的效果，如圖2。通過(guò)繪制ROC 曲線分析，血清Kallistatin 水平及血清HMGB-1 曲線下面積為0.701(95%CI :0.596-0.845，P＜0.001) 和0.748（95%CI :0.649-0.848，P＜0.001）。血清Kallistatin預(yù)測(cè)ILD 患者的臨界值為5.36μg/mL（敏感性33.3%，特異性97.5%），血清HMGB-1 預(yù)測(cè)ILD 患者的臨界值為13.92 ng/mL（敏感性55.6%，特異性97.5%）。

圖2 Kallistatin 及HMGB-1 診斷ILD 的ROC 曲線

2.5 血清Kallistatin 水平及血清HMGB-1 水平與ILD 患者嚴(yán)重程度的相關(guān)性

54 例ILD 患者中有33 例患者行肺功能測(cè)試，4 例因呼吸衰竭無(wú)法行肺功能檢測(cè)。按照綜合生理指數(shù)（CPI）及ILD-GAP 評(píng)分對(duì)ILD 的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)估，并分別與血清Kallistatin 水平及血清HMGB-1 水平進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，如表3顯示，血清HMGB-1 水平與ILD 的嚴(yán)重程度有較強(qiáng) 的 正 相 關(guān) 性（CPI：r=0.455，P＜0.05；ILD-GAP：r=0.506，P＜0.05）。而血清Kallistatin 水平與ILD的嚴(yán)重程度不具有相關(guān)性。

表3 Kallistatin、HMGB-1 與ILD 嚴(yán)重程度相關(guān)性分析

3 討論

ILD 是一組彌漫性間質(zhì)性改變的疾病，以臨床病情嚴(yán)重、預(yù)后差為特點(diǎn)。目前對(duì)ILD 的診斷方法主要基于臨床癥狀、肺功能指標(biāo)和影像學(xué)檢查[14-15]。然而，僅僅依靠這些技術(shù)，某些ILD 依舊無(wú)法進(jìn)行早期確診。并且，肺功能檢查受多種因素影響，反復(fù)的影像學(xué)檢查可能對(duì)患者造成輻射損傷[16-17]。目前尚無(wú)有效的生物標(biāo)志物可對(duì)于ILD進(jìn)行早期診斷和病情監(jiān)測(cè)，因此，需要簡(jiǎn)單有效的生物標(biāo)志物來(lái)實(shí)現(xiàn)ILD 的早期診斷和病情評(píng)估。

kallistatin 是一種內(nèi)源性蛋白質(zhì)，廣泛分布于與心血管功能相關(guān)的組織中，包括肝臟、腎臟、心臟和肺。我們的研究發(fā)現(xiàn)ILD 患者血清kallistatin水平相對(duì)于健康對(duì)照組偏高，提示kallistatin 可能與ILD 的發(fā)病相關(guān)。既往研究顯示，kallistatin 通過(guò)其兩個(gè)結(jié)構(gòu)元件：活性位點(diǎn)和肝素結(jié)合域，調(diào)節(jié)不同的信號(hào)通路和廣泛的生物活性，通過(guò)其肝素結(jié)合位點(diǎn)可以阻斷TGF-β 誘導(dǎo)的多種器官纖維化，比如心臟、肝臟和腎臟[18-20]。因此我們認(rèn)為ILD患者血清kallistatin 水平偏高可能是機(jī)體的自我保護(hù)機(jī)制，通過(guò)上調(diào)kallistatin 的表達(dá)來(lái)抑制肺纖維化的進(jìn)程。這跟在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的特發(fā)性纖維化大鼠實(shí)驗(yàn)中，高kallistatin 水平可以改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺纖維化相吻合[11]。通過(guò)構(gòu)建ROC 曲線分析顯示，血清Kallistatin 水平曲線下面積為0.683(95%CI :0.574-0.792，P=0.002)，其預(yù)測(cè)ILD患者的臨界值為4.02 μg/mL，敏感性為42.6%，特異性為90%。雖然Kallistatin 診斷ILD 敏感性低，但是其診斷特異性較高，因此kallistatin 可以作為診斷ILD 的新型血清生物標(biāo)志物。本研究還評(píng)估了血清kallistatin 水平與ILD 疾病嚴(yán)重程度CPI 和ILD-GAP 評(píng)分的相關(guān)性，結(jié)果提示血清kallistatin水平與ILD 疾病嚴(yán)重程度無(wú)明顯相關(guān)性。

HMGB-1 是一種損傷相關(guān)分子模式，存在于所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞核中，在損傷、感染或其他炎癥刺激下由壞死細(xì)胞釋放，或由活化的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞分泌[21]。當(dāng)細(xì)胞外HMGB-1 與宿主靶細(xì)胞的特定受體結(jié)合時(shí)，它會(huì)觸發(fā)炎癥介質(zhì)的釋放，并在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[22]。在本研究中ILD 患者血清HMGB-1水平相對(duì)于健康人群表達(dá)升高，提示HMGB-1 參與患者ILD 的發(fā)生。其機(jī)制是HMGB-1 通過(guò)促進(jìn)TGF-β1 釋放來(lái)誘導(dǎo)上皮- 間質(zhì)轉(zhuǎn)化和肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致肺纖維化[23-24]。并且既往研究顯示HMGB-1 參與多種器官纖維化的發(fā)病機(jī)制，抑制HMGB-1 的表達(dá)可以減緩纖維化的發(fā)生發(fā)展，如肝臟、腎臟和心臟[25-30]。同樣通過(guò)繪制ROC 曲線，血清HMGB-1 曲線下面積為0.719(95%CI:0.616-0.828，P＜0.001)，其 預(yù) 測(cè)ILD患者的臨界值為18.1 ng/mL，敏感性為51.9%，特異性為92.5%。血清HMGB-1 可以作為診斷ILD的特異性血清生物標(biāo)志物。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)血清HMGB-1 水平與ILD 嚴(yán)重程度呈較強(qiáng)的正相關(guān)性（CPI：r=0.455，P＜0.05；ILD-GAP：r=0.506，P＜0.05），這表明血清HMGB-1 水平可以預(yù)測(cè)患者ILD 的嚴(yán)重程度。

綜上所述，ILD 患者血清HMGB-1 與Kallistatin的水平顯著升高，未來(lái)可以成為輔助診斷ILD 新的生物標(biāo)志物；且血清HMGB-1 水平與ILD 患者的嚴(yán)重程度呈較強(qiáng)的正相關(guān)性，HMGB-1 可成為預(yù)測(cè)ILD 進(jìn)展程度的一種新的指標(biāo)。