劉長(zhǎng)風(fēng)， 王 椰， 段士鑫， 王天楚， 劉學(xué)貴， 高品一

(1. 沈陽(yáng)化工大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110142； 2.沈陽(yáng)化工大學(xué)功能分子研究所，遼寧沈陽(yáng) 110142；3. 沈陽(yáng)化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng) 110142)

紫花苜蓿(L.)為耐寒、耐旱的多年生豆科植物，具有較高的營(yíng)養(yǎng)、經(jīng)濟(jì)及生態(tài)價(jià)值。截至2016年，我國(guó)商品苜蓿年產(chǎn)量已達(dá)100萬(wàn)t，且仍呈上升趨勢(shì)。已有研究表明，紫花苜蓿對(duì)鎘、鉛、釩等重金屬脅迫具有一定耐受性。同時(shí)由于紫花苜蓿生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)量大、可多次刈割，在污染土壤的植被修復(fù)中被廣泛研究和應(yīng)用。本研究旨在探討紫花苜蓿在重金屬鉻脅迫下的抗氧化性及生長(zhǎng)生理響應(yīng)規(guī)律。

主成分分析法(PCA)能將多個(gè)具有相關(guān)性的指標(biāo)通過(guò)數(shù)值分析計(jì)算，轉(zhuǎn)換為少數(shù)互不關(guān)聯(lián)的綜合指標(biāo)，避免了信息的重疊，達(dá)到“降維”的目的；綜合指標(biāo)在涵蓋原有多數(shù)指標(biāo)的基礎(chǔ)上，更直觀地反映了植物逆境脅迫下的內(nèi)在響應(yīng)規(guī)律，因此被廣泛應(yīng)用于植物抗逆性研究中。

本試驗(yàn)以紫花苜蓿為試驗(yàn)材料，通過(guò)水培模擬試驗(yàn)探究其在不同濃度Cr脅迫下種子萌發(fā)、幼苗生理響應(yīng)和鉻積累情況。通過(guò)主成分分析法判斷苜?？剐员憩F(xiàn)的主要生理指標(biāo)，以便更直觀快捷地表征苜蓿在Cr脅迫下的氧化損傷程度及抗氧化應(yīng)激響應(yīng)規(guī)律，以期為探討紫花苜蓿在Cr污染土壤下的生長(zhǎng)情況提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 植物材料與水培試驗(yàn)

試驗(yàn)所用紫花苜蓿品種為金皇后，于2020年9月在遼寧省沈陽(yáng)市進(jìn)行試驗(yàn)。篩選籽粒飽滿(mǎn)的種子于5% NaClO中消毒，每皿(直徑90 mm)放入40粒苜蓿種子，加入Cr處理液[0(CK)、1、5、10、20、30、50 mg/L]和1/2 Hoagland’s營(yíng)養(yǎng)液。在保持Cr濃度恒定期間，于全自動(dòng)光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 10 d，溫度為(20±1) ℃，光照時(shí)間為白天 ∶夜晚= 16 h ∶8 h)。

1.2 苜蓿種子萌發(fā)測(cè)定

按照《國(guó)際種子檢驗(yàn)章程》，于試驗(yàn)第4天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第10 天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、抑制指數(shù)(根、莖)。

1.3 苜蓿幼苗鉻累積測(cè)定

將培養(yǎng)10 d后的苜蓿鮮樣取出清洗、烘干至恒質(zhì)量，用HCl-HNO-HClO消解定容，用火焰原子吸收法測(cè)定幼苗鉻含量。

1.4 苜蓿幼苗生理指標(biāo)測(cè)定

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26.0、Origin 2018對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3個(gè)試驗(yàn)組平均值。采用單因素方差分析法(ANOVA)對(duì)不同濃度Cr處理組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析(=0.05)，采用SPSS 26.0進(jìn)行主成分分析，采用Origin 2018進(jìn)行圖形繪制。

專(zhuān)利間接侵權(quán)制度的輔助侵權(quán)一元立法論............................................................................................徐媛媛 01.80

2 結(jié)果與分析

2.1 Cr6+脅迫對(duì)苜蓿種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

由表1可知，低濃度(5～10 mg/L)Cr脅迫處理可促進(jìn)苜蓿種子萌發(fā)，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)均顯著增加；而種子活力指數(shù)在Cr脅迫下顯著降低(<0.05)，在50 mg/L時(shí)降至CK的12.78%；在Cr脅迫下苜蓿幼苗的根、莖伸長(zhǎng)受到顯著抑制，且根長(zhǎng)受到的抑制作用大于莖。

表1 不同濃度Cr6+脅迫對(duì)苜蓿種子萌發(fā)及幼苗長(zhǎng)勢(shì)的影響

2.2 Cr6+脅迫對(duì)苜蓿幼苗生理指標(biāo)的影響

2.2.1 Cr脅迫對(duì)苜蓿幼苗鉻吸收的影響 由圖1可知，隨Cr脅迫濃度的增加，苜蓿幼苗中鉻吸收量顯著增加(<0.05)，在處理濃度為1～20 mg/L時(shí)，苜蓿幼苗體內(nèi)鉻含量較對(duì)照增加了44～540倍，在50 mg/L時(shí)達(dá)CK的806倍。

2.2.2 Cr脅迫對(duì)苜蓿幼苗根系活力的影響 苜蓿幼苗根系活力隨Cr脅迫濃度增加總體呈下降趨勢(shì)(圖2)。在低濃度(1～5 mg/L)下，苜蓿幼苗根系活力變化不顯著(>0.05)；但在Cr濃度≥10 mg/L 時(shí)，根系活力出現(xiàn)顯著下降(<0.05)，且在濃度為20 mg/L時(shí)降低至CK的50%以下，在50 mg/L時(shí)降至CK的21%。

2.2.3 Cr脅迫對(duì)苜蓿幼苗葉綠素含量的影響 苜蓿幼苗葉片中葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量均隨Cr脅迫濃度的增加先升后降(圖3)。施加1 mg/L Cr時(shí)，苜蓿幼苗葉綠素a及總?cè)~綠素含量顯著增加(<0.05)，隨脅迫加深Cr脅迫濃度與葉綠素含量呈負(fù)相關(guān)，20 mg/L時(shí)均降至CK的50%以下；在50 mg/L時(shí)部分葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。

2.2.5 Cr脅迫對(duì)苜蓿幼苗中MDA含量的影響 苜蓿幼苗中MDA含量隨脅迫濃度增加而上升(圖5)。Cr濃度在5 mg/L時(shí)，幼苗中MDA含量顯著增加(<0.05)；在Cr脅迫濃度為5～30 mg/L時(shí)，MDA含量增加緩慢。Cr脅迫濃度為50 mg/L時(shí)，MDA含量到試驗(yàn)最大值，為0.017 8 μmol/g 。

2.2.6 Cr脅迫對(duì)苜蓿幼苗脯氨酸、可溶性蛋白含量的影響 苜蓿幼苗中脯氨酸含量與Cr濃度呈顯著正相關(guān)(<0.05)，可溶性蛋白含量隨Cr濃度的增加呈先升后降的趨勢(shì)(圖6)。幼苗中可溶性蛋白含量在Cr脅迫濃度為1 mg/L時(shí)達(dá)到試驗(yàn)峰值，較CK增加35.50%，之后隨著Cr濃度增加而顯著下降(<0.05)，并在50 mg/L時(shí)降至CK的86.26%，達(dá)試驗(yàn)最低值。Cr脅迫處理苜蓿體內(nèi)游離脯氨酸含量較CK增加了62.41%～104.68%，在50 mg/L時(shí)達(dá)試驗(yàn)最大值，為57.72 μg/g 。

2.2.7 Cr脅迫對(duì)苜蓿幼苗GSH、AsA含量的影響 由圖7可知，苜蓿幼苗中AsA、GSH、GSH+AsA含量隨Cr脅迫濃度增加均呈先增后降的趨勢(shì)。AsA含量在Cr脅迫濃度為5 mg/L時(shí)出現(xiàn)試驗(yàn)峰值，達(dá)對(duì)照的3.18倍；GSH含量在Cr脅迫濃度為1 mg/L時(shí)顯著增加(<0.05)，1～10 mg/L時(shí)變化不顯著(>0.05)，但整體均在CK的3倍以上，在Cr脅迫濃度為 20 mg/L 時(shí)顯著增加(<0.05)，并在30 mg/L時(shí)含量增至CK的9.81倍。GSH+AsA含量在Cr脅迫濃度為5 mg/L時(shí)達(dá)到CK的3.30倍，且除Cr脅迫濃度為50 mg/L以外，其余各處理組GSH+AsA含量均顯著高于CK(<0.05)。

2.2.8 Cr脅迫對(duì)苜蓿幼苗抗氧化酶活性的影響 由圖8可知，苜蓿幼苗中POD、SOD活性隨Cr脅迫濃度變化而存在差異，POD活性與Cr脅迫濃度呈正相關(guān)，各試驗(yàn)梯度下較CK增加了1.34～2.81倍；SOD活性隨Cr脅迫濃度變化不顯著(>0.05)，整體呈先升后降的趨勢(shì)，各試驗(yàn)梯度下幼苗中SOD活性整體高于對(duì)照，并在10 mg/L時(shí)達(dá)到試驗(yàn)峰值。

2.3 主成分分析

由主成分分析結(jié)果(表2)可知，前3個(gè)主成分方差累積達(dá)90%以上，故前3個(gè)主成分能較好地反映Cr脅迫下苜蓿幼苗主要生理指標(biāo)的變化。由表3中成分矩陣系數(shù)及圖9可知，主成分1的貢獻(xiàn)率達(dá)68%以上，對(duì)主成分1貢獻(xiàn)較大的指標(biāo)為幼苗中的鉻含量、根系活力、MDA含量、POD活性、HO含量，因此當(dāng)苜蓿遭受Cr脅迫時(shí)，幼苗中鉻含量、根系活力、MDA含量、POD活性及HO含量能較好地反映苜蓿的生理變化。后續(xù)研究中可以考慮以這幾項(xiàng)指標(biāo)作為判定苜蓿受脅迫狀況的依據(jù)。

表2 生理指標(biāo)主成分分析方差解釋

表3 成分矩陣

3 討論

種子萌發(fā)期對(duì)Cr脅迫濃度變化敏感，苜蓿種子萌發(fā)情況能較好地反映其Cr耐受水平。研究發(fā)現(xiàn)低濃度Cr可提高苜蓿種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽指數(shù)； 但高濃度Cr脅迫表現(xiàn)出顯著抑制作用。

種子活力指數(shù)是衡量種子發(fā)芽質(zhì)量及幼苗生長(zhǎng)勢(shì)的重要指標(biāo)之一，Cr顯著抑制苜蓿種子活力指數(shù)、根長(zhǎng)及莖長(zhǎng)，且Cr對(duì)根的抑制大于莖。這說(shuō)明Cr濃度對(duì)種子萌發(fā)的影響呈低促高抑趨勢(shì)，但對(duì)種子生長(zhǎng)勢(shì)及苜蓿幼苗后續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育具有顯著的抑制作用。

植物根系是植物受外環(huán)境脅迫的第一道屏障，根系活力是衡量植物根系功能的重要指標(biāo)之一。幼苗根系活力與Cr脅迫濃度存在顯著的劑量效應(yīng)，隨Cr脅迫濃度的增加而根系活力顯著下降，且這種負(fù)相關(guān)效應(yīng)在高濃度Cr脅迫時(shí)更明顯。這是由于植物根系在重金屬脅迫下會(huì)通過(guò)一系列反應(yīng)緩解毒害效應(yīng)，包括減少吸收和阻礙運(yùn)輸以達(dá)到重金屬解毒作用；而過(guò)量的鉻超出根系細(xì)胞壁與液泡區(qū)隔作用閾值，進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，破壞原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)，造成根系活力下降；未被根系阻隔的Cr經(jīng)主動(dòng)運(yùn)輸在葉片中積累，葉綠素是衡量植物光合作用功能的重要指標(biāo)。低濃度(≤5 mg/L)Cr脅迫顯著促進(jìn)了苜蓿幼苗總?cè)~綠素、葉綠素a及葉綠素b合成，而高濃度(≥10 mg/L)Cr脅迫顯著抑制了葉綠素合成，且葉綠素b對(duì)鉻脅迫敏感。這可能是由于低濃度的Cr可增強(qiáng)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收；而高濃度的Cr造成葉綠體膜損傷破裂；同時(shí)由于鉻-鐵互作效應(yīng)降低了植物體內(nèi)活性鐵的可利用性，導(dǎo)致葉綠素合成受阻、影響植物光合作用。

細(xì)胞膜是維持胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，胞外環(huán)境中過(guò)高的重金屬誘導(dǎo)植物體內(nèi)ROS大量積累，造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷，引起膜脂過(guò)氧化反應(yīng)。MDA是衡量細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度的重要指標(biāo)。本研究表明，苜蓿體內(nèi)的MDA含量與Cr脅迫濃度呈顯著正相關(guān)，這說(shuō)明Cr對(duì)苜蓿幼苗細(xì)胞膜有顯著毒害作用。滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)能調(diào)節(jié)植物體內(nèi)滲透壓、維持營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能量吸收，維持植物在逆境下正常的生長(zhǎng)代謝?？扇苄缘鞍缀透彼崾侵参矬w內(nèi)的主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，Cr脅迫下苜蓿幼苗體內(nèi)脯氨酸含量顯著增加，脯氨酸可直接消耗ROS，是植物抗性的重要過(guò)程之一，Cr脅迫下脯氨酸的積累表明苜蓿對(duì)Cr具有一定的抗性；同時(shí)可溶性蛋白也參與細(xì)胞滲透壓的調(diào)節(jié)，本研究發(fā)現(xiàn)苜蓿幼苗在低濃度(≤5 mg/L)Cr脅迫時(shí)體內(nèi)可溶性蛋白含量顯著增加，相反高濃度Cr脅迫下其可溶性蛋白含量下降，這同樣表明苜蓿對(duì)低濃度Cr具有一定的抗性，而高濃度Cr影響蛋白質(zhì)的合成，加速蛋白質(zhì)的分解，造成苜蓿幼苗體內(nèi)可溶性蛋白含量下降。

4 結(jié)論

Cr脅迫濃度≤10 mg/L時(shí)，苜蓿種子萌發(fā)被促進(jìn)。幼苗能通過(guò)調(diào)節(jié)POD活性、脯氨酸含量及GSH+AsA含環(huán)量，維持幼苗體內(nèi)ROS平衡，同時(shí)幼苗葉綠素含量顯著增加(<0.05)，幼苗正常的生長(zhǎng)代謝過(guò)程未受顯著影響。Cr脅迫濃度≥10 mg/L時(shí)，苜蓿幼苗體內(nèi)正常代謝過(guò)程被打亂，氧化損傷加劇，對(duì)苜蓿造成毒害。同時(shí)通過(guò)對(duì)苜蓿氧化脅迫響應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn)，鉻積累量、根系活力、MDA含量、HO含量、POD活性等5個(gè)指標(biāo)能良好地表征苜蓿在Cr脅迫下氧化脅迫響應(yīng)規(guī)律。綜上所述，紫花苜蓿能耐受低濃度(≤5 mg/L)Cr脅迫，而高濃度Cr脅迫對(duì)苜蓿具有顯著的毒害作用。這可以縮減后續(xù)研究應(yīng)用的工作量，為鉻污染土壤下紫花苜蓿等植物生長(zhǎng)提供數(shù)據(jù)支撐。