范子晗，羅雅尹，熊華燁，張育文，康福蓉，王昱桁，王潔，石孝均，張躍強(qiáng)

西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715

0 引言

【研究意義】作為全球最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，2019年我國(guó)19個(gè)省份的柑橘栽培面積和產(chǎn)量分別達(dá)到262萬(wàn)公頃和4 585萬(wàn)噸，均居世界首位。我國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)位于降雨豐沛的熱帶和亞熱帶地區(qū)，土壤酸化和養(yǎng)分不平衡，且pH低和缺氧條件下的土壤銨化率高于硝化率，土壤富含 NH。柑橘園中存在的氮肥不合理施用導(dǎo)致一系列的環(huán)境和生態(tài)問(wèn)題，嚴(yán)重限制了我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，研究柑橘對(duì)酸、堿性土壤中銨態(tài)氮水平的響應(yīng)以及柑橘銨毒害產(chǎn)生機(jī)制，對(duì)指導(dǎo)柑橘生產(chǎn)中氮肥的合理施用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】土壤中氮的礦化和硝化作用是氮循環(huán)中的重要過(guò)程。在酸性土壤中，土壤硝化速率被證明相對(duì)較低，且硝化速率隨著土壤pH的降低而降低。作為柑橘生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)元素，NH-N和NO-N是可被柑橘直接吸收利用的氮源。我國(guó)柑橘年均氮肥用量為494 kg·hm，其中無(wú)機(jī)氮施用量占總量的91.4%。三峽重慶庫(kù)區(qū)柑橘園生產(chǎn)體系中氮素主要來(lái)源于三元復(fù)合肥、尿素和碳銨，土壤酸化和傳統(tǒng)施肥方式導(dǎo)致果園生產(chǎn)體系氮養(yǎng)分高盈余量和高銨硝比，造成果園土壤環(huán)境氮素高負(fù)荷。大量施用含銨肥料導(dǎo)致我國(guó)主要農(nóng)田酸化嚴(yán)重，抑制硝化速率，影響柑橘植株的生長(zhǎng)以及氮素吸收。植物的銨毒害癥狀包括生物量降低、根系構(gòu)型改變、根冠比下降、葉片失綠等。不同種屬或同一種屬不同品種之間也存在不同的銨耐受性，通過(guò)對(duì)前人關(guān)于植物不同氮素形態(tài)的喜好相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，可可樹(shù)、水稻、藍(lán)莓、茶樹(shù)喜銨態(tài)氮；而油菜、棉花、烤煙以及一些藻類(lèi)對(duì)銨態(tài)氮敏感，易出現(xiàn)毒害現(xiàn)象。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，銨中毒是由氧化還原穩(wěn)態(tài)受損引起的，這增加了活性氧（ROS）的產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶（過(guò)氧化物酶POD、過(guò)氧化氫酶CAT、超氧化物歧化酶SOD、抗壞血酸過(guò)氧化物酶 APX）在此時(shí)被激發(fā)來(lái)降低活性氧的累積。植物吸收 NH后，主要的代謝途徑有谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶（GS/GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（GDH）和天冬酰胺合成酶（AS）。銨轉(zhuǎn)化為氨基酸和酰胺的總速率低于通過(guò)氨基酸分解代謝、硝酸鹽還原、苯丙代謝和光呼吸吸收和細(xì)胞生產(chǎn)銨的速率時(shí)，會(huì)造成植物組織銨毒性積累。硝酸還原酶（NR）、天門(mén)冬酰胺酶（AS）、谷氨酰胺合成酶(GS)作為催化和調(diào)節(jié)氮代謝的關(guān)鍵酶，每一種酶都可以看作是植物氮素吸收和利用能力的指標(biāo)。【本研究切入點(diǎn)】目前，我國(guó)關(guān)于柑橘不同形態(tài)氮素施用的系統(tǒng)研究較少，且主要集中在柑橘的氮素喜好、銨硝配比及吸收動(dòng)力學(xué)方面，針對(duì)柑橘銨毒害系統(tǒng)研究鮮見(jiàn)報(bào)道，有待研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選擇我國(guó)具有代表性的砧木——香橙，以銨態(tài)氮為研究對(duì)象，通過(guò)盆栽試驗(yàn)探究酸性土壤中柑橘銨毒害的產(chǎn)生原因、特征及響應(yīng)機(jī)制，為柑橘氮素科學(xué)管理提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與試驗(yàn)材料

試驗(yàn)開(kāi)展于西南大學(xué)國(guó)家紫色土肥力與肥效監(jiān)測(cè)基地。供試酸性土壤為黃壤，pH 4.13，有機(jī)質(zhì)含量 4.98 g·kg，堿解氮 83.1 mg·kg，有效磷 4.20 mg·kg，速效鉀 73.0 mg·kg。供試石灰性土壤為紫色土，pH 8.50，有機(jī)質(zhì) 21.2 g·kg，堿解氮 52.0 mg·kg，速效磷 13.3 mg·kg，速效鉀為 156 mg·kg。土壤速效磷測(cè)定時(shí)酸性土壤采用Bray法，堿性土壤采用 Olsen法。土壤經(jīng)自然風(fēng)干，去除雜質(zhì)后磨細(xì)過(guò)篩備用。供試柑橘砧木幼苗為香橙（Tanaka）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)為雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，主處理為2種土壤，分別為黃壤和紫色土。副處理為5個(gè)銨態(tài)氮水平，分別為 0、50、100、200、400 mg·kg，分別用 A0、A50、A100、A200和A400表示。每個(gè)處理10次重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)方法

2019年10月種子經(jīng)催芽萌發(fā)后移栽入苗圃，2020年1月待種子長(zhǎng)到5葉齡時(shí)，移入盆中。盆高21 cm，直徑21 cm，每盆裝土6 kg，磷鉀肥作為基肥裝盆時(shí)與土混勻裝入。過(guò)磷酸鈣供磷，施磷量100 mg·kg，硫酸鉀供鉀，施鉀量150 mg·kg。一盆種植兩株柑橘砧木幼苗。利用分析純硫酸銨試劑在2020年11月以營(yíng)養(yǎng)液形式按照處理要求一次施入，其余按照柑橘種植常規(guī)管理進(jìn)行，土壤含水量保持為田間持水量的70%。處理前一周布置土壤溶液采集器（Rhizon 19.21.01 SMS），如圖1。

圖1 土壤溶液采集裝置示意圖Fig. 1 Schematic diagram of soil solution collection device

1.4 樣品采集與項(xiàng)目測(cè)定

1.4.1 樣品采集 通過(guò)土壤溶液采集器隔天采集土壤溶液，并將采集液置于-20℃冰箱保存。于試驗(yàn)第15天和第30天各取5盆采集柑橘幼苗的地上部和地下部，把采集的柑橘根莖葉分開(kāi)，用去離子水洗凈后晾干。取一部分根、莖、葉稱鮮重后，在105℃殺青2 h后在75℃烘干并記下干重，烘干后粉碎用于元素分析；另一部分根和葉用液氮速凍后保存在-80℃冰箱用于生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.4.2 土壤溶液 使用流動(dòng)分析儀（AA3）測(cè)定土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的質(zhì)量濃度；土壤溶液 pH用電位計(jì)法測(cè)定。

1.4.3 植株丙二醛含量 用10%三氯乙酸研磨至勻漿后離心，取上清液與0.5%硫代巴比妥酸反應(yīng)后于450、532和 600 nm下比色。

1.4.4 植株氮含量的測(cè)定 用HSO-HO消煮，并用半微量凱氏定氮法測(cè)定氮含量。

1.4.5 抗氧化系統(tǒng)酶活性 氮同化酶活性以及植株銨態(tài)氮硝態(tài)氮含量采用試劑盒法，試劑盒由蘇州科銘生物技術(shù)有限公司提供。

1.4.6 參數(shù)計(jì)算 本文中涉及的相關(guān)指標(biāo)計(jì)算公式如下：

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行雙因素和單因素的方差分析（ANOVA）。均數(shù)分析采用最小差異檢驗(yàn)（LSD）進(jìn)行比較（＜0.05），使用Excel進(jìn)行圖表的制作。

2 結(jié)果

2.1 土壤類(lèi)型與銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)土壤溶液銨態(tài)氮硝態(tài)氮濃度的影響

如圖2所示，兩種土壤的土壤溶液銨態(tài)氮濃度均隨硫酸銨施用量的增加而上升。與酸性土壤相比，石灰性土壤的銨態(tài)氮濃度下降較快。如圖3所示，兩種土壤的土壤溶液的銨硝比均呈先下降后穩(wěn)定的趨勢(shì)，石灰性土壤溶液銨硝比在施用硫酸銨后15 d左右已經(jīng)趨近于0，而酸性土壤土壤溶液在24 d依然保持4.52的銨硝比，并呈穩(wěn)定趨勢(shì)。

圖2 銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)土壤溶液銨態(tài)氮，硝態(tài)氮含量的影響Fig. 2 Effects of NH4+-N levels on concentrations of ammonium nitrogen and nitrate nitrogen in soil solution

圖3 銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)土壤溶液銨硝比的影響Fig. 3 Effects of NH4+-N level on NH4+/NO3- of soil solution

如圖4所示，兩種土壤在施用硫酸銨后pH均下降，到了第24天時(shí)，與A0相比，A50、A100、A200、A400處理酸性土壤的pH分別降低了0.077，0.290，0.190和0.113個(gè)單位；石灰性土壤的pH降低了0.170，0.713 ，0.743 和0.777個(gè)單位。

圖4 銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)土壤溶液pH的影響Fig. 4 Effect of NH4+-N level on pH of soil solution

2.2 兩種土壤中銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)柑橘生長(zhǎng)的影響

由表1可知，葉片和地上部的生物量呈先上升后下降趨勢(shì)，在A100處理時(shí)達(dá)到最大值，與A0處理相比分別上升了 20.2%和 16.6%。不同銨態(tài)氮施用量下的莖、根、總生物量及根冠比無(wú)顯著差異。如表2所示，銨態(tài)氮水平下酸性土壤中生長(zhǎng)的幼苗根長(zhǎng)顯著大于石灰性土壤，而根表面積、根體積和根平均直徑無(wú)顯著差異。酸性土壤上生長(zhǎng)的柑橘幼苗根系的根長(zhǎng)、根表面積和根體積隨施銨量上升呈先上升后下降趨勢(shì)。A50處理的根長(zhǎng)最高，較A0處理上升了34.6%，而A400處理時(shí)最低，較A0處理降低了13.0%。不同銨態(tài)氮水平下柑橘的根表面積、根體積和根平均直徑無(wú)顯著差異。由圖5可見(jiàn)，兩種土壤柑橘根系活力與銨態(tài)氮水平呈顯著負(fù)相關(guān)性，酸性土壤=0.82，石灰性土壤=0.28。

表1 銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)柑橘生物量的影響Table 1 Effects of NH4+-N levels on citrus biomass

表2 兩種土壤中銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)柑橘幼苗根系形態(tài)的影響Table 2 Effects of NH4+-N levels on root morphology of citrus seedlings in two soils

圖5 兩種土壤中銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)柑橘幼苗根系活力的影響Fig. 5 Effects of NH4+-N levels on root activity of citrus seedlings in two soils

2.3 兩種土壤中銨供應(yīng)水平對(duì)柑橘抗氧化系統(tǒng)的影響

由表3可見(jiàn)，兩種土壤中生長(zhǎng)的柑橘葉片的CAT和SOD活性有顯著差異，APX和POD無(wú)明顯差異。根系的CAT、SOD和POD活性有顯著差異，且酸性土壤中生長(zhǎng)的柑橘根系CAT、SOD活性小于石灰性土壤，POD活性大于石灰性土壤。不同供應(yīng)水平下，柑橘葉片的CAT和APX活性無(wú)明顯差異；而SOD和POD隨銨態(tài)氮施用量的提高呈先上升后下降趨勢(shì)，分別在A50和A100處理達(dá)到最大值，與A0處理相比分別提高了4.53%和469%。CAT、APX、SOD和POD在15和30 d取樣時(shí)的活性均有顯著差異，除POD以外，其他酶的活性均為30 d低于15 d。各施銨處理的根系CAT、APX、SOD和POD酶活性均大于A0處理。SOD和POD活性隨著施銨量的上升呈先上升后下降趨勢(shì)，分別在A100和A200處理達(dá)到最大值，分別比A0處理上升了44.7%和66.9%。CAT、APX、SOD和POD在15和30 d取樣時(shí)的活性均有顯著差異。CAT和SOD的活性30 d取樣的低于15 d取樣的，APX和POD的活性30 d取樣的大于15 d取樣的。

表3 銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)不同土壤中柑橘抗氧化酶活性的影響Table 3 Effects of NH4+-N levels on antioxidant enzyme activities in citrus leaves grown in different soils

2.4 兩種土壤中銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)柑橘氮代謝的影響

如表4所示，兩種土壤中生長(zhǎng)的柑橘葉片和根系的各氮代謝酶活性均有顯著差異。酸性土壤中生長(zhǎng)的柑橘葉片 GS、NR和GDH活性低于石灰性土壤，而AS和GOGAT活性高于石灰性土壤；而酸性土壤中生長(zhǎng)的柑橘根系GS、GOGAT、AS和NR活性高于石灰性土壤，而GDH活性低于石灰性土壤。隨著銨態(tài)氮水平的上升，葉片GS、GOGAT、GDH的活性均在 A100處理時(shí)達(dá)到最大值，先上升后下降趨勢(shì)，但是葉片NR的活性隨著銨態(tài)氮上升而下降。根系的GS和GOGAT活性隨著銨態(tài)氮的升高呈先上升后下降趨勢(shì)，分別在A200和A100處理達(dá)到最大值；GDH和NR活性隨銨態(tài)氮的升高而降低，AS活性隨銨態(tài)氮水平的升高而升高。從取樣時(shí)間來(lái)看，不同取樣時(shí)間對(duì)酶活性有顯著影響，根系除 GDH活性15 d取樣的低于30 d的外，GS、AS、NR和GOGAT活性均為15 d取樣的高于30 d。葉片除NR的活性15 d取樣的小于30 d以外，30 d取樣的GS、GOGAT、GDH活性均為15 d取樣的高于30d。

表4 銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)不同土壤中柑橘葉片氮代謝酶活性的影響Table 4 Effects of ammonium levels on nitrogen metabolism enzyme activities in citrus leaves on different soil

如表5所示，酸性土壤中葉片和根系硝態(tài)氮顯著低于石灰性土壤，而銨態(tài)氮沒(méi)有顯著差異。根系葉片的銨態(tài)氮含量隨銨態(tài)氮水平的提高呈先上升后下降趨勢(shì)，而硝態(tài)氮含量無(wú)顯著差異。如表6所示，酸性土壤中生長(zhǎng)的柑橘葉氮含量均低于石灰性土壤，而莖和根無(wú)顯著差異；除酸性土壤上生長(zhǎng)的柑橘莖、葉和總的氮累積量均低于石灰性土壤，根系沒(méi)有顯著差異。隨著施銨量的升高，柑橘莖、葉和根的氮含量呈先上升后下降趨勢(shì)，且在 A200處理時(shí)達(dá)到最大值。柑橘的莖、葉、根和總的累積量隨銨態(tài)氮水平呈先上升后下降趨勢(shì)，根、莖和葉在A200處理達(dá)到最大值，總累積量在A100處理時(shí)達(dá)到最大值。

表5 銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)不同土壤中柑橘葉片和根中無(wú)機(jī)氮含量的影響Table 5 Effects of NH4+-N levels on inorganic nitrogen content in citrus leaves in different soils

表6 銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)不同土壤中柑橘葉片氮含量和累積量的影響Table 6 Effects of NH4+-N levels on nitrogen concentration and accumulation in citrus leaves in different soils

通過(guò)柑橘各部位的生物量、氮累積量、氮濃度、葉綠素含量和根系形態(tài)指標(biāo)進(jìn)行聚類(lèi)分析（圖6）。柑橘形態(tài)指標(biāo)的聚類(lèi)結(jié)果顯示，當(dāng)平均距離為10時(shí)，可以將酸性土壤中的銨態(tài)氮水平處理分成兩類(lèi)。當(dāng)堿性土壤中的銨態(tài)氮水平平均距離為20時(shí)，不施氮處理和施氮處理各分成兩類(lèi)。

圖6 銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)香橙生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)聚類(lèi)分析Fig. 6 Cluster analysis of NH4+-N level on growth related indexes of Xiangcheng seedling

3 討論

3.1 酸性土壤和石灰性土壤銨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化過(guò)程

土壤硝化作用對(duì)土壤pH高度敏感，土壤最大硝化速率與土壤 pH呈顯著正相關(guān)。研究顯示，pH每降低一個(gè)單位，土壤的硝化速率就會(huì)減少42%。在本研究中，酸性土壤的土壤溶液中銨態(tài)氮更高，銨硝比保持較高狀態(tài)（圖2，圖3），這與鮑俊丹等在培養(yǎng)試驗(yàn)中的結(jié)果一致。一般認(rèn)為土壤 pH與硝化作用的這種關(guān)系可能是由于低pH抑制硝化微生物的生長(zhǎng)，故不利于硝化作用的進(jìn)行，而在堿性土壤條件下氨氧化菌豐度較大，適宜硝化作用的進(jìn)行。同時(shí)，施用硫酸銨后酸性土壤和石灰性土壤的pH均有下降，與前人對(duì)茶園土壤的研究一致。

3.2 兩種土壤銨態(tài)氮供應(yīng)水平對(duì)柑橘生長(zhǎng)發(fā)育的影響

氮素具有促進(jìn)柑橘生長(zhǎng)，增加生物量的作用，有研究認(rèn)為樹(shù)種對(duì)氮素形態(tài)的偏好與土壤pH相關(guān)，推測(cè)柑橘具有喜銨性。但在對(duì)產(chǎn)區(qū)大多分布在酸性土壤的柑橘研究中發(fā)現(xiàn)，與硝態(tài)氮相比，銨態(tài)氮對(duì)柑橘的根、莖、葉以及總生物量均產(chǎn)生了顯著抑制，表現(xiàn)出明顯的喜硝性。在本試驗(yàn)中，30 d的試驗(yàn)對(duì)柑橘生物量無(wú)顯著差異（表1），這說(shuō)明短期高銨對(duì)柑橘生物量影響不大。但高銨對(duì)柑橘根系伸長(zhǎng)和根系活力產(chǎn)生了抑制作用（表2，圖2），這可能是由于根系作為生長(zhǎng)于土壤中吸收、運(yùn)輸 NH的主要器官，是高NH脅迫下最直接的響應(yīng)和被毒害器官，與前人的研究結(jié)果表現(xiàn)一致。高銨增加了MDA含量，并激發(fā)了根系的氧化應(yīng)激反應(yīng)（表3），說(shuō)明高銨加劇了膜脂過(guò)氧化程度。且植物的抗氧化系統(tǒng)酶可以有效地清除活性氧，保護(hù)其免受破壞性的氧化反應(yīng)，與前人的研究結(jié)果一致。由于 NH特性和酶活性的復(fù)雜性，導(dǎo)致酶活性的變化規(guī)律不一致：高銨增加了葉片POD酶活性，而其他抗氧化酶活性變化不大（表3），推測(cè)POD是此時(shí)起主要作用的抗氧化酶。

3.3 柑橘氮代謝對(duì)兩種土壤銨態(tài)氮供應(yīng)水平的響應(yīng)

植物對(duì)氮素的吸收和累積表現(xiàn)了同化和利用氮的能力。本研究中，酸性土壤柑橘根系中GS、GDH、AS和NR的活性較高。酸性土壤柑橘葉片中GOGAT和GDH活性較高，GS和AS的活性較低。并且高銨降低了根系GOGAT和GDH的活性而增加了AS和GS的活性，高銨增加了葉片AS的活性，降低了NR的活性（表4），與前人的研究結(jié)果一致。這是由于在植物體內(nèi)經(jīng)一系列的生化過(guò)程，NH離子不斷產(chǎn)生，這些離子在植物細(xì)胞中的積累導(dǎo)致組織損傷，造成銨毒性癥狀的出現(xiàn)，與前人的研究結(jié)果一致。這些因素共同作用促進(jìn)植物的氮代謝，是植物的基本生理過(guò)程。本研究酸性土壤中，柑橘植株的銨態(tài)氮含量顯著大于石灰性土壤（表5），且柑橘幼苗的根莖葉的總氮累積量較低（表6），這可能由于石灰性土壤經(jīng)過(guò)硝化作用產(chǎn)生的大量硝態(tài)氮會(huì)對(duì)毒害作用進(jìn)行緩解。

綜上所述，土壤中的氮素轉(zhuǎn)化與土壤的pH密切相關(guān)，酸性土壤上施銨量超過(guò)100 mg·kg時(shí)柑橘幼苗的生長(zhǎng)受到抑制，而在石灰性土壤上過(guò)量使用銨態(tài)氮并未顯著抑制柑橘生物量，意味著銨毒害的強(qiáng)度與土壤的硝化作用強(qiáng)度密切相關(guān)。

4 結(jié)論

與石灰性土壤相比，酸性土壤銨態(tài)氮施用過(guò)量導(dǎo)致土壤溶液中銨離子長(zhǎng)時(shí)間累積，對(duì)柑橘造成毒害。銨毒害現(xiàn)象首先發(fā)生在根系，表現(xiàn)為抑制柑橘根系伸長(zhǎng)且降低根系活力，同時(shí)造成葉片和根系MDA含量增加，細(xì)胞膜受損和氮代謝失調(diào)等銨毒害現(xiàn)象，說(shuō)明柑橘銨毒害與土壤硝化作用密切相關(guān),酸性土壤中尤為值得關(guān)注。