曹婉怡，彭斌，朱亞磊，趙琴，王金泉

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

沙門氏菌是革蘭氏陰性兼性厭氧細菌，于19世紀首次分離出豬霍亂沙門氏菌（Salmonellasp.）[1]。作為人畜共患傳染病的主要傳染源之一，沙門氏菌傳播途徑多樣，經(jīng)食物鏈可引起人和多種動物的急性或慢性傳染病[2]。肉制品作為沙門氏菌的攜帶體，屠宰加工時可通過操作人員、加工工具、運輸?shù)韧緩綌y帶并傳播沙門氏菌[3]。

目前，沙門氏菌耐藥現(xiàn)象較為普遍[4]。Kroger等[5]對149株沙門氏菌進行10種以上的抗生素耐藥檢測，結(jié)果顯示，超過七成樣品存在不同程度的耐藥，其中超半數(shù)對兩種或兩種以上藥品敏感。在廣州地區(qū)進行非傷寒菌株耐藥性調(diào)查發(fā)現(xiàn)，氨芐西林的耐藥性最高，磺胺甲基異惡唑、頭孢他啶和環(huán)丙沙星也呈較高的耐藥性[6]，表明存在一定的安全隱患[7]。本研究以烏魯木齊某羊屠宰場為樣品采集地，對該地沙門氏菌的流行情況進行調(diào)查，并進行多種抗生素敏感試驗，以期為沙門氏菌的防控與治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集

2021年5月在烏魯木齊市某羊屠宰場采集112份樣品（57份羊胴體拭子、30份羊腸內(nèi)容物、25份操作環(huán)境拭子）。無菌生理鹽水浸潤的棉簽涂抹羊胴體表面、操作工具及操作臺表面；刮取羊腸內(nèi)容物后，立即放入提前準備好的甘油肉湯中并標記，24 h內(nèi)送回待檢。

1.1.2 標準菌株

鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311，保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院畜產(chǎn)品質(zhì)量安全實驗室。1.1.3試劑與儀器

主要試劑：營養(yǎng)瓊脂（NA）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液基礎(chǔ)（TTB）、亞砷酸鹽胱氨酸增菌液（SC）、MH肉湯、LB肉湯、緩沖蛋白胨水（BPW）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、0.1%煌綠溶液和碘溶液、PCR相關(guān)試劑均購自青島日水生物技術(shù)有限公司。

主要儀器：恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、基因擴增儀（PCR儀）、凝膠成像系統(tǒng)GELDOCXR（BIO-RAD公司）。

1.1.4 引物序列（見表1）

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

根據(jù)參考文獻確定inv A基因[8]并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.5 藥敏試驗材料

選取11種藥物的藥敏紙片，包括：β-內(nèi)酰胺類：氨芐西林（AMP）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢曲松（CRO）；氨基糖苷類：卡那霉素（KAN）、慶大霉素（GEN）、妥布霉素（TOB）；喹諾酮類：環(huán)丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NOR）、氧氟沙星（OFX）；四環(huán)素類：四環(huán)素（TET）、酰胺醇類：氯霉素（CHL）；均購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 分離純化

根據(jù)參考文獻[9]的方法操作。吸取2 mL含有樣品的甘油肉湯加入裝有2 mL BPW的滅菌離心管中，37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后的樣品進行分裝處理，取1 mL培養(yǎng)液加入10 mL TTB（加入0.1%煌綠溶液、碘溶液，每100 mL/支）內(nèi)，再取1 mL培養(yǎng)液加入10 mL SC內(nèi)。將兩種增菌液做好標記均放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)振蕩培養(yǎng)24 h。取出培養(yǎng)后的菌液，采用滅菌后的接種環(huán)蘸取菌液一環(huán)，分別在XLD和BS平板上，使用平板劃線法涂布，分別放入37和42℃環(huán)境中培養(yǎng)24、48 h；重復(fù)前一步驟3～4次，即得到理想菌落。

1.2.2inv-APCR鑒定

使用水煮法[10]提取模板；反應(yīng)結(jié)束后，將與預(yù)期片段大小一致的產(chǎn)物進行測序、比對。

PCR擴增體系：2×Taq PCR Master mix 10 μL、inv AF 1 μL、inv A-R1 μL、超純水11 μL、模板2 μL。

PCR擴增條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，59℃退火45 s，72℃延伸45 s，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.2.3 保菌

陽性菌復(fù)蘇培養(yǎng)，取單一菌落進行純培養(yǎng)，使用60%甘油以1∶1比例將陽性菌制成甘油菌，-20℃保存。

1.2.4 藥敏試驗

使用上述藥物對陽性分離株采用紙片擴散法進行藥敏試驗。采用滅菌棉拭子蘸取復(fù)蘇后的菌液，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板；依次放置藥敏片，紙片之間距離為2 cm，37℃培養(yǎng)24 h，以標準菌株作為質(zhì)控菌株并做2個平行重復(fù)，測量抑菌圈直徑以便判斷結(jié)果。結(jié)果表現(xiàn)依據(jù)標準[11]進行判定，分為耐藥（resistance，R）、中介（intermediary，I）及敏感（sensitive，S）。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果（見圖1）

由圖1可知，37℃培養(yǎng)24 h后，沙門氏菌在XLD培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為粉紅色并帶有黑色中心的菌落；經(jīng)42℃培養(yǎng)48 h后，BS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為黑色有金屬光澤的菌落。

圖1 分離純化結(jié)果Fig.1 Separation and purification results

2.2 invA PCR鑒定結(jié)果（見圖2）

由圖2可知，使用PCR法對疑似分離株進行inv A特異性基因鑒定，有20株片段與預(yù)期大小一致，約284 bp。

圖2 部分樣品invA基因擴增鑒定結(jié)果Fig.2 PCR analysis of inv A gene in some samples

對上述產(chǎn)物進行測序并將結(jié)果在NCBI比對，結(jié)果顯示，有16株與GenBank上沙門氏菌序列同源性達99%以上，確定為沙門氏菌。

2.3 沙門氏菌分離鑒定結(jié)果

對在屠宰場采集的112份樣品，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)基培養(yǎng)和PCR鑒定相結(jié)合的方法，共分離鑒定得到16株沙門氏菌，總陽性率為14.29%（16/112）。

其中，羊酮體陽性率12.28%（7/57）、羊腸內(nèi)容物陽性率13.33%（4/30）、操作環(huán)境拭子陽性率20.00%（5/25）。

2.4 沙門氏菌藥敏試驗結(jié)果（見表2）

由表2可知，16株菌株對氨芐西林（68.75%）、頭孢噻肟（100.00%）和頭孢曲松（100.00%）表現(xiàn)高度耐藥；對氯霉素、四環(huán)素、諾氟沙星中介率較高，分別為62.50%、56.25%、56.25%；對氧氟沙星敏感率最高，但僅為37.50%。

表2 沙門氏菌藥敏試驗結(jié)果Tab.2 Salmonella susceptibility test results

3 討論

由沙門氏菌引起的群體性食源性疾病愈發(fā)受到重視，已被世界衛(wèi)生組織認定為最常見食源性疾病病源之一[12]。人與動物的直接接觸可能在一定程度上促進耐藥菌株在宿主之間的迅速傳播，能夠密切接觸到耐藥菌株的人相對存在更大程度上被感染的風險[13]?？股氐氖褂檬悄退幓騻鞑サ年P(guān)鍵因素。在動物性食品產(chǎn)業(yè)鏈中，抗生素一直作為治療劑、預(yù)防性藥物以及生長促進劑普遍應(yīng)用，在一定程度上加劇了耐藥菌的傳播[14]。

國家疾病預(yù)防控制中心在2001年對生肉等7大類中國食品致病菌的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，生肉中沙門氏菌的平均污染率為9.35%[15]。本試驗對烏魯木齊某羊屠宰場112份樣品進行沙門氏菌檢測，結(jié)果顯示，16份樣本顯示陽性，檢出率為14.29%。不同研究中沙門氏菌檢出率的差異性，可能受調(diào)查對象不同、采樣季節(jié)變化、屠宰衛(wèi)生條件、運輸銷售、分離方法等因素影響。因此，烏魯木齊市食源性沙門氏菌的污染情況不容忽視，應(yīng)加強監(jiān)督管理。

大量研究表明，肉制品產(chǎn)業(yè)鏈中存在耐藥性細菌[16]，抗生素的使用是引起耐藥菌出現(xiàn)的關(guān)鍵因素。因此，本研究對該屠宰場分離到的16株沙門氏菌進行11種抗生素的耐藥性檢測，結(jié)果顯示，16株分離株均表現(xiàn)敏感，其中對β-內(nèi)酰胺類表現(xiàn)為高度耐藥，且對頭孢噻肟、頭孢曲松高達100%，可能是由于在養(yǎng)殖過程中β-內(nèi)酰胺類藥物主要用于預(yù)防治療其他疾病有關(guān)。

羊源沙門氏菌通過食物鏈傳播，耐藥菌極易再傳播，不僅影響畜牧業(yè)發(fā)展，還會威脅人類健康，抗生素類藥物的規(guī)范使用迫在眉睫。故應(yīng)當加強對耐藥菌的監(jiān)督和檢測，以便積極應(yīng)對沙門氏菌耐藥性問題。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，該屠宰場中存在沙門氏菌污染現(xiàn)象，并且存在不同程度上的耐藥現(xiàn)象。因此，需加強屠宰加工環(huán)節(jié)的管控措施，加大管理力度，完善場內(nèi)消毒的方法并提高消毒頻次，以降低沙門氏菌的污染概率；同時還應(yīng)規(guī)范養(yǎng)殖過程中抗生素藥物的使用，從源頭控制藥物耐藥性問題。