袁翠，蘇柳玥，吳倩玲，羅鑫旭，林玉，吳江

（廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

卵巢是影響蛋雞產(chǎn)蛋性能的重要器官，隨著產(chǎn)蛋期延長，蛋雞卵巢正常的生理功能開始出現(xiàn)功能衰退。姜禮文等[1]研究表明，蛋雞卵巢功能下降可能與氧化應(yīng)激加重有關(guān)；蛋雞排卵過程中會(huì)產(chǎn)生大量活性氧簇（ROS），連續(xù)大量地排卵會(huì)抑制卵泡顆粒細(xì)胞促性腺激素受體的表達(dá)，使卵泡數(shù)量下降，影響卵巢正常功能。姜黃素（curcumin）是一種提取自姜科植物姜黃等的根莖中的黃色色素。王曉寧等[2]研究表明，姜黃素對(duì)小鼠卵巢氧化應(yīng)激引起的生殖器官損傷具有保護(hù)作用。宋傳勝等[3]研究表明，姜黃素作用于產(chǎn)蛋后期的蛋雞能夠顯著提高產(chǎn)蛋量。

Sirtuins是一種進(jìn)化上高度保守的去乙?；割悾瑥V泛分布于各類組織器官和細(xì)胞，具有不同的亞細(xì)胞定位和功能。Sirt1大量存在于胚胎早期和生殖細(xì)胞中，與眾多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、能量代謝以及調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老凋亡的過程密切相關(guān)[4]。Sirt2基因在多種組織中表達(dá)，表達(dá)水平隨細(xì)胞周期的改變而改變，且在有絲分裂期表達(dá)量最高[5]；此外，Sirt2也參加卵母細(xì)胞中的紡錘體組織和染色體分離[6]。Sirt3主要定位于生物細(xì)胞線粒體中，在代謝旺盛的組織如肌肉、腎臟、肝臟中表達(dá)較高[7-8]，在卵巢組織也有發(fā)現(xiàn)。而上述基因在姜黃素作用下的蛋雞卵巢中的變化尚無研究報(bào)道，本試驗(yàn)通過在蛋雞日糧中添加姜黃素，觀察蛋雞卵巢組織切片，并檢測Sirt1、Sirt2、Sirt3基因的表達(dá)量變化，試驗(yàn)結(jié)果為姜黃素調(diào)控Sirt1、Sirt2、Sirt3在蛋雞卵巢中的表達(dá)和作用機(jī)制研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

13月齡羅曼粉蛋雞購自廣州喜迎珍禽公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）、電子天平（上海冠唯儀器有限公司）、手動(dòng)移液器（艾本德國際貿(mào)易有限公司、賽默飛世爾科技有限公司）、冷凍離心機(jī)（揚(yáng)州曦瑪離心機(jī)有限公司）、離心機(jī)（北京天根生化科技有限公司）、PCR儀（上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司）、凝膠成像系統(tǒng)（廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司）、三恒電泳儀（北京市六一儀器廠）、4℃冰箱（北京福意電氣有限公司）、-80℃冰箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）、電子天平（上海冠唯儀器有限公司）、實(shí)驗(yàn)室專用超純凈水機(jī)（重慶科迪實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）、微波爐（美的集團(tuán)有限公司）、光學(xué)顯微鏡（上海山漢光電科技有限公司）等。1.1.3試驗(yàn)試劑

RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）、PCR mix（北京索萊寶科技有限公司）、100 bp DNA Marker（北京索萊寶科技有限公司）、硼酸（廣東光華科技股份有限公司）、EDTA（賽默飛世爾科技有限公司）、三羥甲基氨基甲烷（Tris，上海源葉生物科技有限公司）、瓊脂糖（北京蘭杰柯科技有限公司）、EB替代品（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、EP管（上海脈諾金屬表面處理技術(shù)有限公司）、姜黃素（含量95%，鄭州天順食品有限公司）、壓榨葵花仁油（山東魯花集團(tuán)有限公司）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇21只13月齡羅曼粉蛋雞，選取1只雞為對(duì)照組（CK組），基礎(chǔ)日糧和灌喂4 mL壓榨葵花仁油；其余20只雞在飼喂基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上，按質(zhì)量體重比進(jìn)行姜黃素灌喂，分為低劑量組C1組（4 mg/kg）、中劑量組C2組（20 mg/kg)、高劑量組C3組（100 mg/kg)、超高劑量組C4組（500 mg/kg），每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只雞?；A(chǔ)日糧配方、飼喂環(huán)境和管理與本實(shí)驗(yàn)室前期研究相同[9]，試驗(yàn)期為4周?；A(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平Tab.1 Basic diet composition and nutritional level

1.2.2 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，采用放血的方式處死試驗(yàn)動(dòng)物，及時(shí)取出完整卵巢，PBS溶液清洗干凈。獲得的卵巢組織切片剪成玉米粒大小，一份放入1.5 mL EP管中，加入4%多基甲烷，4℃冰箱保存；另一份分別置于4個(gè)1.5 mL EP管中，-80℃冰箱保存。

1.2.3 卵巢組織切片的制作及HE染色

卵巢迅速放到配制好的Bouin氏固定液中固定72 h，洗凈，放入全自動(dòng)真空組織脫水儀中脫水、透明，取出后進(jìn)行石蠟包埋、切片。卵巢組織切片脫蠟至蒸餾水，蘇木素染色5 min，沖洗；0.5%鹽酸乙醇分化30 s，水浸泡15 min，伊紅液染色2 min；70%、80%、90%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ酒精，每個(gè)梯度脫水1 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ各透明2 min，最后采用中性樹脂封固。

1.2.4 PCR的提取及反轉(zhuǎn)錄

Trizol法提取RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增目的條帶。PCR體系（20 μL）：ddH2O 6 μL、cDNA 2 μL、PCRmix 10 μL以及上、下游引物各2 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s；52℃退火30 s，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸1 min；72℃延伸5 min；12℃保存。

1.2.5 基因擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

采用1%的瓊脂糖凝膠電泳液檢測PCR產(chǎn)物，電泳電壓80 V，時(shí)間40 min。電泳結(jié)束后，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察熒光條帶。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用光學(xué)顯微鏡對(duì)蛋雞卵巢組織切片進(jìn)行觀察分析。得到的DNA熒光條帶采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行處理，再進(jìn)行T檢驗(yàn)分析。結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 姜黃素對(duì)13月齡羅曼粉蛋雞卵巢組織的影響（見圖1～圖3）

由圖1～圖3可知，在光學(xué)顯微鏡下觀察卵巢切片，在CK組、C1組、C2組、C3組和C4組的蛋雞卵巢組織中均發(fā)現(xiàn)初級(jí)卵母細(xì)胞（圖2）和次級(jí)卵母細(xì)胞（圖3）。初級(jí)卵母細(xì)胞周圍由一層立方形卵泡細(xì)胞包裹，卵泡膜和卵泡腔未形成，次級(jí)卵母細(xì)胞被多層立方形卵泡細(xì)胞所包裹，體積比初級(jí)卵母細(xì)胞大，未形成卵泡腔。其中C1組和C3組還發(fā)現(xiàn)了原始卵母細(xì)胞（見圖1），卵原細(xì)胞周圍被一層扁平狀的卵泡細(xì)胞包裹，無卵泡膜和卵泡腔。CK組卵巢組織中卵泡細(xì)胞周圍的組織細(xì)胞減少，形成大量的空白，但與CK組的初級(jí)卵母細(xì)胞和次級(jí)卵母細(xì)胞相比，C1組、C2組、C3組和C4組中的卵巢組織均未形成空白，且卵泡內(nèi)容物明顯增多和著色點(diǎn)也有所增加。

圖1 蛋雞卵巢組織切片HE染色（原始卵母細(xì)胞）Fig.1 HE staining of ovary tissue sections of laying hens(primordial oocytes)

圖2 蛋雞卵巢組織切片HE染色（初級(jí)卵母細(xì)胞）Fig.2 HE staining of ovary tissue sections of laying hens(primary oocytes)

圖3 蛋雞卵巢組織切片HE染色（次級(jí)卵母細(xì)胞）Fig.3 HE staining of ovary tissue sections of laying hens(secondary oocytes)

2.2 Sirt1基因的PCR檢測和相對(duì)表達(dá)量分析（見圖4）

由圖4（a）可知，內(nèi)參基因和Sirt1的擴(kuò)增條帶單一，且清晰可見，位置大小合適。對(duì)凝膠電泳后所得出的條帶進(jìn)行灰度分析，得出的各基因檢測值除以內(nèi)參基因，結(jié)果見圖4（b）。由圖4（b）可知，與CK組相比，C1組、C2組Sirt1表達(dá)量差異均不顯著（P＞0.05），C3組和C4組的Sirt1表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），且C3組高于C4組。

圖4 Sirt1基因的PCR檢測和相對(duì)表達(dá)量分析Fig.4 PCR detection and relative expression analysis of Sirt1 gene

結(jié)果表明，姜黃素可增加蛋雞卵巢組織中Sirt1基因的表達(dá)量，其中C3組和C4組效果顯著（P＜0.05），且以C3組效果更為理想。

2.3 Sirt2基因的PCR檢測和相對(duì)表達(dá)量分析（見圖5）

由圖5（a）可知，內(nèi)參基因和Sirt2的擴(kuò)增條帶單一，且清晰可見比較亮眼，位置大小合適。對(duì)凝膠電泳后所得出的條帶進(jìn)行灰度分析，得出的各基因檢測值除以內(nèi)參基因，結(jié)果見圖5（b）。

由圖5（b）可知，與CK組相比，C1組、C2組的Sirt2基因表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；C3組、C4組的Sirt2基因表達(dá)量極顯著升高（P＜0.01）。

圖5 Sirt2基因的PCR檢測和相對(duì)表達(dá)量分析Fig.5 PCR detection and relative expression analysis of Sirt2 gene

結(jié)果表明，一定劑量的姜黃素能夠有效提高Sirt2基因表達(dá)量的影響，其中C3組效果最為理想。

2.4 Sirt3基因的PCR檢測和相對(duì)表達(dá)量分析（見圖6）

圖6 Sirt3基因的PCR檢測和相對(duì)表達(dá)量分析Fig.6 PCR detection and relative expression analysis of Sirt3 gene

由圖6（a）可知，內(nèi)參基因和Sirt3的擴(kuò)增條帶單一，且清晰可見比較亮眼，位置大小合適。對(duì)凝膠電泳后所得出的條帶進(jìn)行灰度分析，得出的各基因檢測值除以內(nèi)參基因，結(jié)果見圖6（b）。

由圖6（b）可知，與CK組相比，C1組、C3組的Sirt3表達(dá)量顯著提高（P＜0.05），C2組的Sirt3表達(dá)量極顯著提高（P＜0.01），C4組差異不顯著（P＞0.05）。

結(jié)果表明，姜黃素可增加蛋雞卵巢組織中Sirt3基因的表達(dá)量，其中C1組和C3組效果顯著（P＜0.05），但C2組效果更為理想。

3 討論

3.1 姜黃素對(duì)卵巢組織的影響

姜黃素作為一種提取自姜科植物姜黃等根莖的黃色色素，具有抗氧化、抗炎、保護(hù)肝臟和腎臟的功能，且作為動(dòng)物飼料添加劑無明顯的毒副作用[10]。王志[11]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加姜黃素提高了羅曼蛋雞血液中鈣、磷以及總蛋白和白蛋白的含量，降低了總膽固醇和甘油三酯含量；表明添加姜黃素可提高羅曼蛋雞的生產(chǎn)性能并改善了蛋品質(zhì)，且以添加量為200 mg/kg時(shí)效果最好。本試驗(yàn)在產(chǎn)蛋后期蛋雞的基礎(chǔ)日糧中添加不同劑量的姜黃素，飼喂一段時(shí)間后，通過采集蛋雞卵巢組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組的蛋雞卵巢組織出現(xiàn)了一定的機(jī)體組織損傷，卵巢組織細(xì)胞形成空腔減少，但對(duì)比對(duì)照組和各處理組雞的卵巢組織切片，發(fā)現(xiàn)4個(gè)處理組的卵泡內(nèi)容物明顯增多，著色點(diǎn)增加。由此可知，姜黃素可使產(chǎn)蛋后期蛋雞的卵巢組織形態(tài)發(fā)生改變，進(jìn)一步推測姜黃素對(duì)產(chǎn)蛋后期蛋雞的卵巢具有保護(hù)和修復(fù)組織形態(tài)的可能性。

3.2 姜黃素對(duì)蛋雞卵巢組織中基因表達(dá)的影響

3.2.1 姜黃素對(duì)Sirt1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

有研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物卵巢生理機(jī)制[12]，提高卵巢抗氧化性能；Sirt1基因在卵巢組織中的表達(dá)可延緩卵巢組織細(xì)胞衰老和凋亡[13-15]。也有研究表明，Sirt1基因在卵巢中的表達(dá)水平下調(diào)會(huì)增加顆粒細(xì)胞的凋亡[16]，但有關(guān)姜黃素對(duì)調(diào)控家禽性器官上Sirt1基因的研究較少見。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，姜黃素能夠不同程度地影響Sirt1基因在蛋雞卵巢中的表達(dá)量，且以C3組和C4組影響最為顯著，但C4組的基因表達(dá)量低于C3組。結(jié)果表明，姜黃素在作為家禽飼料添加劑的使用過程中需要注意用量，使用過量的姜黃素可能會(huì)出現(xiàn)反面效果。綜上，姜黃素能夠提高Sirt1基因在蛋雞卵巢中的表達(dá)，由此可進(jìn)一步推測，姜黃素能夠通過調(diào)控Sirt1基因延緩蛋雞卵巢組織細(xì)胞衰老和凋亡。

3.2.2 姜黃素對(duì)Sirt2基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

在基因水平上，Sirt2蛋白表達(dá)水平在有絲分裂過程中顯著上調(diào)，能夠顯著延長有絲分裂期。在細(xì)胞周期的G2/M期，Sirt2絲氨酸的368位點(diǎn)可被細(xì)胞周期調(diào)節(jié)子CDK1磷酸化[17-18]。Sirt2能夠參與細(xì)胞增殖，為其在多種組織中廣泛表達(dá)提供了依據(jù)，但有關(guān)姜黃素對(duì)羅曼粉蛋雞的卵巢組織結(jié)構(gòu)和Sirt2基因表達(dá)影響的研究較為缺乏。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，姜黃素能夠不同程度地影響Sirt2基因在蛋雞卵巢中的表達(dá)量，C1組和C2組Sirt2基因的表達(dá)量顯著升高；C3組和C4組Sirt2基因的表達(dá)量極顯著升高。結(jié)果表明，添加姜黃素可影響13月齡羅曼粉蛋雞卵巢中Sirt2基因的表達(dá)量，使卵巢中Sirt2的表達(dá)量有所上調(diào)，且添加100 mg/kg姜黃素時(shí)效果最為明顯。

3.2.3 姜黃素對(duì)Sirt3基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

影響雞的生長條件因素主要是環(huán)境因素所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)，可能導(dǎo)致其食欲下降，生產(chǎn)性能降低。雞出現(xiàn)采食量下降，攝入的能量、維生素及礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分減少，導(dǎo)致雞生長減慢。大量研究表明，Sirt3不僅可以參與調(diào)控機(jī)體自身的免疫，還能夠調(diào)節(jié)代謝[19]。本研究中，與對(duì)照組相比，姜黃素能夠不同程度地影響Sirt3基因在蛋雞卵巢中的表達(dá)量，與CK組相比，C1組和C3組的Sirt3表達(dá)量顯著提高，C2組的Sirt3表達(dá)量極顯著提高。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，添加姜黃素能夠提高Sirt3基因表達(dá)量，且添加20 mg/kg姜黃素時(shí)效果最為明顯。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，姜黃素能夠改變蛋雞卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)，增加卵泡內(nèi)容物和著色點(diǎn)；與對(duì)照組相比，灌喂不同劑量的姜黃素均可提高蛋雞卵巢中的Sirt1、Sirt2、Sirt3表達(dá)量；與對(duì)照組相比，C3組、C4組的Sirt1表達(dá)量顯著提高；C1組、C2組的Sirt2基因表達(dá)量顯著提高，C3組、C4組的Sirt2基因表達(dá)量極顯著提高；C2組Sirt3基因表達(dá)量極顯著提高，C1組、C3組的Sirt3基因表達(dá)量顯著提高。本試驗(yàn)條件下，姜黃素最優(yōu)劑量推薦100 mg/kg。