鄭陸紅，張慧瓊，陳 茹

（1.廣東省食品工業(yè)研究所有限公司，廣東廣州 511442；2.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 511442；3.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站，廣東廣州 511442）

氧氟沙星是一種人工合成抗菌藥物，具有抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透力強(qiáng)和價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于畜牧、水產(chǎn)等養(yǎng)殖業(yè)中水產(chǎn)動物的疾病預(yù)防與治療[1-5]。氧氟沙星易殘留于動物組織，通過食物鏈循環(huán)進(jìn)入人體，形成耐藥性，長期食用含有該藥物殘留的食品，可危害人類健康[6-7]。2015年我國農(nóng)業(yè)部第2292號公告[8]規(guī)定水產(chǎn)品中不得使用氧氟沙星。近年來，國家市場監(jiān)督管理總局食品安全監(jiān)督抽檢中關(guān)于食用農(nóng)產(chǎn)品涉及的水產(chǎn)品項(xiàng)目中喹諾酮類獸藥殘留超標(biāo)的通告較多[9-12]，其中氧氟沙星項(xiàng)目占據(jù)較大比例。因此，檢測水產(chǎn)品中氧氟沙星藥物的含量非常有必要。

食品檢驗(yàn)過程會受到諸多不確定因素的影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果與真值之間存在一定的誤差[13-14]。為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，真實(shí)反映被測量估計(jì)值的不確定度，需要對不確定度進(jìn)行測量與分析。測量不確定度一般由若干個分量組成，表征賦予被測量值分散性的非負(fù)參數(shù)[15-16]。測量不確定度用于判斷測量結(jié)果的可靠程度，檢測過程中影響結(jié)果的不確定度來源及影響程度[17]。本文依據(jù)《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》及《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[18-19]，結(jié)合《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（農(nóng)業(yè)部1077號公告—1—2008）對水產(chǎn)品中氧氟沙星殘留量的不確定度進(jìn)行測量與分析，評定測量不確定度[20]。通過對其進(jìn)行不確定度評定，分析檢測過程中的不確定度來源及各分量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度，為控制及減少實(shí)驗(yàn)過程中所產(chǎn)生的不確定度提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

水，一級水；甲醇、乙腈、醋酸銨和甲酸，均為色譜純；無水硫酸鈉（650 ℃灼燒4 h，冷卻后貯于密閉容器中備用）；氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：82419-36-1，純度≥95.71%）；諾氟沙星-D5標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號：1015856-57-1，純度≥99.7%）；液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）；分析天平；渦旋混合器；超聲波清洗儀；離心機(jī)；均質(zhì)器；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理過程

①稱取5 g樣品于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入50 μL 諾氟沙星 -D5（1 μg·mL-1）內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，渦旋混勻，避光放置10 min。②加入10 g無水硫酸鈉，渦旋混勻，再加入20 mL甲酸-乙腈（1∶99）溶液，渦旋混合1 min，超聲波提取10 min，離心，移取上清液。③殘?jiān)性偌尤?0 mL甲酸-乙腈（1∶99）溶液，重復(fù)提取1次。④合并兩次提取液于40 ℃水浴中氮?dú)獯蹈?。⑤?.0 mL 20%甲醇溶解殘留物，再加入2.0 mL正己烷渦旋混合，轉(zhuǎn)入5 mL離心管中，離心，取下層清液過0.22 μm濾膜后供UHPLCMS/MS分析測定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制

氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取10.53 mg氧氟沙星，用乙腈溶解，并定容到10 mL容量瓶中，得到濃度為1 008 μg·mL-1的氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

諾氟沙星-D5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取4.92 mg諾氟沙星-D5，用甲酸+甲醇（2+98）溶解，并定容到10 mL容量瓶中，得到濃度為491 μg·mL-1的諾氟沙星-D5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取0.05 mL氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)儲備液置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到濃度為1.008 μg·mL-1的氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

諾氟沙星-D5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取0.11 mL諾氟沙星-D5標(biāo)準(zhǔn)儲備液置于50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到濃度為1.08 μg·mL-1的諾氟沙星-D5標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。

氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)中間液0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.50 mL、1.00 mL和0.50 mL諾氟沙星-D5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL A級容量瓶中，用20%甲醇溶液定容至刻度，搖勻。氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度分別為 5.04 ng·mL-1、10.08 ng·mL-1、20.16 ng·mL-1、50.40 ng·mL-1和 100.80 ng·mL-1，諾氟沙星-D5內(nèi)標(biāo)濃度為54.0 ng·mL-1。

1.2.3 色譜條件

色 譜 柱：phenomenex-C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），柱溫：40 ℃，流動相：A為0.1%甲酸水、B為甲醇，流速：0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量：1 μL。梯度洗脫程序：0～0.50 min，90%A；0.50～5.00 min，90%A～ 10%A；5.00～ 6.00 min，10%A；6.00～6.01 min，10%A～90%A；6.01～7.00 min，90%A。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

樣品中氧氟沙星殘留量采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法及同位素內(nèi)標(biāo)法定量，定量結(jié)果計(jì)算公式為

式中：X為試樣中氧氟沙星的殘留量，μg·kg-1；C為從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線上得到的被測組分濃度，ng·mL-1；V為試樣最終定容體積，mL；W為樣品質(zhì)量，g。

2.2 不確定度來源分析

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UHPLC-MS/MS）測定水產(chǎn)品（魚）中氧氟沙星殘留量的不確定度來源主要有標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中產(chǎn)生的不確定度、定容體積產(chǎn)生的不確定度、樣品稱量過程中產(chǎn)生的不確定度、樣品進(jìn)行重復(fù)測定產(chǎn)生的不確定度、最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的不確定度以及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀引入的不確定度等。

不同的因素及其影響見圖1。

圖1 UHPLC-MS/MS法測定水產(chǎn)品中（魚）氧氟沙星的不確定度來源圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量評定

2.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)工作液產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,1(S)

（1）配制氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,2(P)。查閱氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書可知，其擴(kuò)展不確定度為0.46%（k=2），純度為95.71%，則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為[0.46%÷(2×95.71%)]2=5.775×10-6。

標(biāo)準(zhǔn)曲線所用內(nèi)標(biāo)溶液與試樣溶液所用內(nèi)標(biāo)溶液為同一溶液且加入的量一致，因此配制諾氟沙星-D5內(nèi)標(biāo)溶液過程中稱樣量、稀釋體積及純度的不確定度的分量可忽略不計(jì)，只考慮內(nèi)標(biāo)溶液取樣體積引入的不確定度。

（2）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,3(m1)。氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是由十萬分之一電子天平進(jìn)行稱量。根據(jù)電子天平檢定證書，最大允許誤差（MPE）為 ±0.05 mg，按矩形分布（）計(jì)算，稱取氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.010 53 g，其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為7.516×10-6。

（3）配制標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程中所用器具引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,4(V1)。配制氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液過程中所用器具引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度主要來源為容量瓶定容體積、移液槍移取溶液。配制所用的容量瓶經(jīng)鑒定均為A級，可按國家規(guī)范《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）規(guī)定，按三角分布計(jì)算，移液器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，由校準(zhǔn)證書得到，按三角分布計(jì)算，配制氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液過程中所用器具的最大允許誤差及相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方如表1所示。

表1 配制氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液過程中所用器具引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

配制氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中所用器量引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方為=6.667×10-7+1.667×10-7+3.334×10-6+3.750×10-5+1.125×10-4+1.167×10-4=2.709×10-4。

（4）標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制過程中所用量器溫度系數(shù)引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量urel,5(T1)。氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液均在（20±4）℃條件下進(jìn)行配制，溶液溫度與檢定標(biāo)準(zhǔn)溫度（20 °C）不同產(chǎn)生了相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量urel,5(T1)?？赏ㄟ^估算該體積膨脹系數(shù)和溫度范圍計(jì)算其引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。液體的體積膨脹明顯大于玻璃容器體積膨脹，故只考慮前者即可。乙腈的膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃-1，甲醇的膨脹系數(shù)為1.19×10-3℃-1，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，按照矩形分布計(jì)算，配制氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液過程中，所用器具溫度系數(shù)引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方見表2。

表2 配制氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液過程中所用器具溫度系數(shù)引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

配制氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作溶液時(shí)溫度變化引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方為)=1.002×10-5+7.553×10-6+1.176×10-6+7.553×10-6+7.056×10-7+1.647×10-6= 2.866×10-5。

綜上，配制氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方為=5.775×10-6+7.516×10-6+2.709×10-4+2.866×10-5=3.13×10-4。

2.3.2 樣品前處理過程中產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,6(Q)

（1）樣品前處理過程中稱量產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,7(m)。通過查閱萬分之一的電子天平使用說明書，稱量5.000 0 g時(shí)，最大允差為0.5 mg，按矩形分布（），用該天平秤量樣品6份，得到5 023.3 mg、5 061.5 mg、5 067.2 mg、5 077.0 mg、5 051.2 mg和5 061.3 mg，方差為342.4 mg，所用校準(zhǔn)砝碼引起的不確定度貢獻(xiàn)較小，忽略不計(jì)。稱取樣品產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方為=(342.4÷6)+(0.52÷3)=57.15 mg。

稱取樣品質(zhì)量為5.023 3 g、5.061 5 g，其平均值為5.042 4 g，產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方為

（2）樣品處理過程中所用量器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,8(V3)。本方法采用內(nèi)標(biāo)法定量，樣品前處理時(shí)使用1 000 μL移液槍移取400 μL諾氟沙星-D5內(nèi)標(biāo)（1.08 μg·mL-1）加入至樣品中。使用 1 000 μL 移液槍移取1 000 μL 20%甲醇溶液進(jìn)行定容。由于氧氟沙星含量超線性范圍，樣品定容后需再稀釋8倍，使用200 μL移液槍取125 μL樣液，加20%甲醇溶液定容至1.00 mL容量瓶。1 000 μL移液槍的最大容量允差為 ±10.0 μL，200 μL 移液槍最大允差為 ±3.0 μL，1 mL容量瓶的最大允差為±0.010 mL，依據(jù)三角分布，樣品處理過程中所用器量產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

（3）溫度系數(shù)引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量urel,12(T3)。樣品是在（20±4）℃條件下進(jìn)行定容，溶液溫度與檢定標(biāo)準(zhǔn)溫度（20 °C）不同產(chǎn)生了相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量urel,12(T3)。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃-1，甲醇的膨脹系數(shù)為 1.19×10-3℃-1，按照矩形分布計(jì)算（）。內(nèi)標(biāo)中間液主要成分是甲醇，樣品定容溶液和稀釋液的主要成分是水，樣品處理過程中溫度系數(shù)產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度平方為

綜上，樣品前處理過程中產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,6(Q)的平方為2.248×10-6+8.751×10-5+8.259×10-6=9.81×10-5。

2.3.3 樣品重復(fù)性測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的相對不確定度urel,17(C)

（1）樣品測量結(jié)果重復(fù)性偏差產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u(X)。選用一份陽性的樣品，選取6份，經(jīng)處理后，進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表3。

表3 樣品重復(fù)性測定結(jié)果（單位：ng·mL-1）

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的標(biāo)準(zhǔn)偏差引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。將氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)系列溶液測定3次，得到氧氟沙星與諾氟沙星-D5峰面積之比，取平均值。以氧氟沙星與諾氟沙星-D5的濃度之比X為橫坐標(biāo)，氧氟沙星與諾氟沙星-D5峰面積之比Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。用最小二乘法擬合求出一元回歸方程及相關(guān)系數(shù)，計(jì)算結(jié)果見表4。

表4 氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)系列溶液3次測定的結(jié)果

采用最小二乘法擬合濃度-峰面積之比的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，線性回歸方程為y=4.169 4x-0.173；相關(guān)系數(shù)為r=0.999 9，大于0.995，符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）標(biāo)準(zhǔn)要求，說明氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度與諾氟沙星-D5標(biāo)準(zhǔn)系列溶液濃度之比和氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)系列溶液與諾氟沙星-D5標(biāo)準(zhǔn)系列溶液峰面積之比具有顯著的線相關(guān)性。根據(jù)貝塞爾公式，標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)差SR為

式中：yij為氧氟沙星與諾氟沙星-D5峰面積之比；yi為回歸直線計(jì)算的值；n為標(biāo)準(zhǔn)工作液的點(diǎn)數(shù)，n=5；m為標(biāo)準(zhǔn)工作液每個測量點(diǎn)重復(fù)測量次數(shù)，m=3。

（3）回歸系數(shù)斜率a產(chǎn)生的不確定度u(a)的平方為

（4）回歸系數(shù)截距b產(chǎn)生的不確定度u(b)的平方為

（5）儀器測量結(jié)果產(chǎn)生的不確定度。u(x)、u(y)、u(a)、u(b)之間相互獨(dú)立不相關(guān)，根據(jù)公式：

氧氟沙星各分量靈敏系數(shù)為

合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc(c)的平方為

樣品重復(fù)性測定及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的相對不確定度的平方為

2.3.4 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel,18(I)

根據(jù)廣東省計(jì)量科學(xué)研究出具的儀器校準(zhǔn)證書，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀引入的相對擴(kuò)展不確定度Urel=10%，k=2，按照矩形分布得到儀器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的平方為

2.4 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評定ucrel(X)

根據(jù)含量計(jì)算公式，水產(chǎn)品（魚）中氧氟沙星殘留量測定的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度由標(biāo)準(zhǔn)工作液配制產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度、定容體積產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度、樣品稱量過程中所產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度、樣品進(jìn)行重復(fù)性測定產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度等分量組成，結(jié)果見表5。

表5 UPHLC-MS/MS法測定黃骨魚中氧氟沙星含量測定的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度的分量

因此UHPLC-MS/MS法測定水產(chǎn)品（魚）中氧氟沙星含量測定的合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.5 擴(kuò)展不確定度的評定

當(dāng)樣品中氧氟沙星的含量為 66.1 μg·kg-1，在95%置信區(qū)間，包含因子k=2，則其擴(kuò)展不確定度為UP=kp×urel=2×3.78×6.1=5.0 μg·kg-1。

3 結(jié)論

當(dāng) 樣品中 氧氟沙星 含量為 66.1 μg·kg-1時(shí)，取置信水平p=95%（k=2），則其結(jié)果可以表示為（66.1±5.0）μg·kg-1（k=2）。通過計(jì)算合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度可得知，UHPLC-MS/MS測定水產(chǎn)品（魚）中氧氟沙星殘留量的實(shí)驗(yàn)過程中各分量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響程度的大小，為評定方法及結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了可靠的依據(jù)。相對于樣品前處理過程中產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，配制標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度和儀器測量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度對總合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度影響較大。為了控制標(biāo)準(zhǔn)工作液配制工程中產(chǎn)生的誤差，應(yīng)使用高純品的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，檢定合格的器具，定期對儀器進(jìn)行校準(zhǔn)。根據(jù)實(shí)際情況選擇合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，提高檢驗(yàn)員人員的操作水平，減少操作過程引入的不確定度。