張麗靜，郭曉冬，韓江升

（1.威海市文登區(qū)檢驗檢測中心，山東威海 264400；2.山東威高藥業(yè)股份有限公司，山東威海 264200)

蛋白質的攝入為人的生命活動提供了豐富的氨基酸。其中，雞蛋的食用是居民日常蛋白質的主要來源之一[1-2]。為提高蛋雞的生存率及產蛋率，在蛋雞養(yǎng)殖過程中不合規(guī)使用或者濫用藥物已經成為養(yǎng)殖戶的常規(guī)手段，也是近幾年在檢驗檢測過程中發(fā)現(xiàn)的常見性問題[3-7]。在這些藥物中，喹諾酮類獸藥是近年來人工合成的一系列新型殺菌性抗菌藥物，因其抗菌譜廣，抗菌活性強，耐藥性和毒副作用小等特點被廣泛應用于動物的多種感染性疾病的防治[8]。長期食用含較低濃度喹諾酮類藥物的動物源性食品，容易誘導人類產生致病菌耐藥性，具有潛在致畸致癌的威脅[9]。中國和歐盟都規(guī)定了在動物組織中喹諾酮類獸藥的最高殘留量。通過儀器快速準確地測定雞蛋中喹諾酮類獸藥的殘留具有重要的現(xiàn)實意義。目前我國已經制定了相關的檢測標準對不同種類的食品中的喹諾酮類藥物進行檢測。

本研究參照食品安全國家標準的檢測方法，選取雞蛋的日常監(jiān)管過程中檢測頻率較高的6種喹諾酮類藥物，整合優(yōu)化檢測方法，建立了一種簡便、高效、準確的基于固相萃取和高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定雞蛋中6種喹諾酮類藥物殘留量的檢測方法，該方法具有良好的回收率、穩(wěn)定性和實用性。

1 材料與方法

1.1 材料

雞蛋，購于文登大潤發(fā)商業(yè)有限公司。

1.2 試劑

甲醇、乙腈（色譜純，美國TEDIA）；甲酸（色譜純，美國賽默飛世爾科技有限公司）；乙酸銨（分析純，天津市永達化學試劑有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；標準物質（購于北京壇墨質檢科技股份有限公司）：恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、諾氟沙星-D5，質量濃度均為 100 μg·mL-1。

1.3 儀器設備

TSQ Quantum Ultra EMR System三重四極桿液相色譜質譜聯(lián)用儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Oasis PRiME HLB Cartridge Plus Shor（t335 mg，Waters公司）；PL2002，0.01 g電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；3-18KS高速冷凍離心機（SIGMA公司）；N-1300旋轉蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社）；N-EVAPTM 112氮吹儀（美國organomation公司）；AH-30全自動均質儀（?？萍瘓F股份有限公司）；C18色譜柱：Hypersil gold（C18），100 mm×2.1 mm，3.0 μm（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 標準溶液的配制

（1）恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、諾氟沙星-D5混合內標溶液的配制。分別準確吸取1 mL 100 μg·mL-1的恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8、諾氟沙星-D5內標標準溶液，用乙腈稀釋配成10 μg·mL-1的混合內標標準工作液。

（2）恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星和洛美沙星6種藥物混合標準工作液的配制。準確吸取1 mL 100 μg·mL-1的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星和洛美沙星藥品標準物質，用乙腈稀釋成濃度為10 μg·mL-1的混合標準工作液。

（3）6種喹諾酮藥物標準曲線溶液的配制（內標法）。分別取適量的6種喹諾酮藥物混合標準工作液和3種氘代混合內標標準工作液，用乙腈稀釋成6種喹諾酮藥物濃度為 10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、80 μg·L-1、100 μg·L-1和 200 μg·L-1的系列標準工作液。

1.4.2 供試樣品前處理

準確稱取勻漿后的蛋液5 g（精確到0.01 g），置于50 mL聚乙烯離心管中，依次加入3種氘代內標混合標準工作液50 μL，25 mL含1%甲酸的乙腈溶液，均質 2 min（轉速 12 000 r·min-1），加入 5 g無水硫酸鈉，蓋緊旋塞劇烈振搖2 min，離心5 min（4 000 r·min-1），使有機相和水相分層。取出上層有機相于100 mL雞心瓶中，旋轉蒸發(fā)濃縮至1～2 mL，放冷，用乙腈稀釋至5.0 mL，搖勻。

取上述制備的提取液5 mL，通過Oasis PRiME HLB Cartridge Plus Shor（t335 mg）凈化，收集全部凈化液，混勻，取1 mL凈化液在40 ℃水浴中氮吹至近干，用1 mL乙腈-水（1∶9，v∶v）定容，混勻，經0.22 μm微孔濾膜過濾后上機檢測。

1.4.3 儀器條件

（1）色譜條件。柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流速：0.2 mL·min-1；流動相：溶劑 A（含 5 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸溶液），溶劑B為甲醇；梯度洗脫條件：0～ 1 min，10%B；1～ 7 min，10%B → 35%B；7～ 9 min，35%B→ 70%B；9～ 12 min，70%B；12.1～15.0 min，10%B。

（2）質譜條件。離子源（HESI）；多反應監(jiān)測（SRM）；氬氣為碰撞氣；碰撞氣壓力為0.2 Pa；樣品傳輸管溫度為350 ℃；蒸發(fā)器溫度為300 ℃；鞘氣流速為35 Arb；輔助氣流速為10 Arb；噴霧電壓為3 500 V；離子掃描模式為正離子掃描模式。

（3）離子參數(shù)的優(yōu)化。分別取濃度為1 μg·mL-1的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星、培氟沙星和洛美沙星各藥物單標溶液，采用流動注射分析法進樣，用軟件自帶的優(yōu)化功能分別對各個化合物進行優(yōu)化，選擇信號強度較高的兩組離子對作為定性和定量離子。優(yōu)化后的離子參數(shù)見表1。

表1 6種喹諾酮類藥物及內標化合物的離子參數(shù)及碰撞能量

2 結果與分析

2.1 線性范圍的測定

將1.4.1（3）配制的系列標準溶液上機測定，以待測化合物與內標化合物峰面積比值（y）為縱坐標，對應質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線，以S/N=3確定儀器檢出限。由表2可知，在10～200 μg·L-1，各種藥物呈良好的線性關系，相關系數(shù)R2均大于0.99。以信噪比（S/N）為3計算方法的檢出限（LOD），得6種喹諾酮類藥物的LOD在1～4 μg·L-1，完全滿足檢測需求。

表2 6種待測化合物線性方程、線性范圍、R2及檢出限

2.2 方法的回收率和精密度

以雞蛋陰性樣品為基質，分別添加10 μg·kg-1、80 μg·kg-1、200 μg·kg-1這 3 個濃度的喹諾酮類藥物混合標準溶液，每個濃度做6個平行樣品，采用內標法定量。由表3可知，在3個加標水平下，6種喹諾酮類藥物的回收率為70.4%～117.8%，RSD均在15% 以內。表明本方法靈敏度高、準確性好，可以滿足雞蛋中6種喹諾酮類藥物的檢測需求。

表3 6種喹諾酮類藥物回收率（n=6）

2.3 檢測方法的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

食品安全國家標準中用到的提取溶劑主要包括兩種，即酸化乙腈和磷酸鹽緩沖液。實驗發(fā)現(xiàn)用磷酸鹽緩沖液作為提取溶劑時，即使用高速離心機離心后，提取液仍不易澄清，在后續(xù)過柱凈化的過程中過柱非常緩慢。而用酸化乙腈提取時，后續(xù)過固相萃取柱凈化就比較容易，所以本文選用酸化乙腈作為提取溶劑。

2.3.2 凈化材料的選擇

雞蛋是卵磷脂含量最高的食物之一，此外還含有大量的脂肪；在樣品處理過程中，簡單有效的凈化手段對實驗結果的準確性尤為關鍵，本實驗在樣品前處理過程中采用Oasis PRiME HLB固相萃取柱進行凈化，可以有效去除干擾物質，并且使待測物保持了較高的回收率。

2.3.3 定量方法的選擇

為消除樣品處理過程中目標物的損失和基質效應等因素的影響，本實驗選用同位素內標法來進行定量，同位素內標法以待測組分和同位素內標物的響應信號比來定量，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。

3 結論

本文以酸化乙腈作為提取溶劑，以Oasis PRiME HLB Cartridge Plus Short凈化柱作為凈化材料用于雞蛋的前處理，結合同位素內標質譜法分析檢測了6種喹諾酮類藥物殘留，建立了同位素質譜內標法測定雞蛋中6種喹諾酮類藥物的方法，并對方法進行了驗證。結果表明，本文所建立的檢測方法的線性方程、準確度、精密度和檢出限等指標都滿足檢測需求，表明該檢測方法是準確可靠、簡便的，可用于日常對雞蛋中喹諾酮類藥物殘留的監(jiān)測分析。