韓珍珍

（運(yùn)城市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山西運(yùn)城 044000）

由微生物引起的一系列食源性疾病是世界范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一[1]。我國每年由微生物導(dǎo)致的食物中毒占全部食源性疾病的50%左右[2-4]。其中，由蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）引發(fā)的食物中毒問題越來越受到人們的關(guān)注。該菌為兼性厭氧的桿狀革蘭氏陽性菌，為芽孢桿菌科蠟樣芽孢桿菌屬，廣泛存在于空氣、水體、土壤等環(huán)境中，為植物和動(dòng)物的主要污染源，因此無法避免地會(huì)污染到食品[5]。少量蠟樣芽孢桿菌不會(huì)引起食物中毒，但當(dāng)被蠟樣芽孢桿菌污染的食物加熱不徹底，其會(huì)在食物中呈指數(shù)生長(zhǎng)產(chǎn)生腸毒素，危害人體健康[6]。一般認(rèn)為蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒屬毒素型食物中毒。據(jù)國內(nèi)外報(bào)道，幾乎所有種類的食品中都有檢測(cè)到蠟樣芽孢桿菌[7-8]。本文對(duì)385份預(yù)包裝類食品進(jìn)行了蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)分析，期望為預(yù)防食品安全風(fēng)險(xiǎn)隱患，保障人們的飲食安全提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

共采集8類預(yù)包裝食品385份，分別為手抓餅、漢堡餅胚、速凍餡餅、糕點(diǎn)、餅干、速凍餃子、薯類和膨化食品和淀粉及淀粉制品，分別從各縣市超市、零售店、批發(fā)市場(chǎng)及農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)以及網(wǎng)店購買。

1.2 菌株與試劑

陽性菌株：蠟樣芽孢桿菌（ATCC11778）；陰性菌株：蘇云金芽孢桿菌（ATCC10792）、蕈狀芽孢桿菌（CICC21473）、巨大芽孢桿菌（ATCC14581）、大腸埃希氏菌[CMCC（B）44102]；甘露醇卵黃多粘菌素（MYP）瓊脂（200706）；動(dòng)力培養(yǎng)基（200528）；硫酸錳營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（201204）；胰酪胨大豆羊血（TSSB）瓊脂（200330）；溶菌酶營養(yǎng)肉湯（2090819）；生化鑒定試劑盒（200518）；革蘭氏染色液（陸橋，批號(hào)：200831）；BCL鑒定卡（梅里埃）。

1.3 儀器與試劑

BM-20AY落射熒光顯微鏡帶照相系統(tǒng)（上海光學(xué)儀器）、濁度儀（法國生物梅里埃公司）、VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）、BHC-1300Ⅱ生物安全柜（蘇凈集團(tuán)）、生化培養(yǎng)箱（上海博迅）。

1.4 檢測(cè)方法

本試驗(yàn)根據(jù)GB 4789.14-2014標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)385份樣品進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)。對(duì)檢出蠟樣芽孢桿菌的樣品取n=5進(jìn)行檢驗(yàn)，依次編號(hào)為01～05共5組，每組做兩個(gè)平行，步驟依次為增菌、分離、鑒定（生化鑒定和全自動(dòng)生化鑒定儀）、計(jì)數(shù)。此次檢測(cè)前對(duì)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境、關(guān)鍵培養(yǎng)基、菌種進(jìn)行了驗(yàn)證，確保實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)包裝食品中蠟樣芽孢桿菌檢出情況

通過對(duì)385份預(yù)包裝食品進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)，只有速凍餡餅和速凍餃子中檢出蠟樣芽孢桿菌，總檢出率為1.04%，合格率為98.96%。其中，速凍餡餅中蠟樣芽孢桿菌檢出率為5.17%；速凍餃子中蠟樣芽孢桿菌檢出率為1.27%，在幾類食品中速凍餡餅檢出率最高。具體結(jié)果見表1。

表1 各類預(yù)包裝食品中蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)結(jié)果

2.2 蠟樣芽孢桿菌生化鑒定結(jié)果

2.2.1 革蘭氏染色、動(dòng)力、溶菌酶耐性、溶血、根狀生長(zhǎng)和毒素結(jié)晶試驗(yàn)結(jié)果

以培養(yǎng)出典型菌落的速凍餡餅樣品為例，進(jìn)行分析鑒定。挑取粉紅色有沉淀環(huán)的可疑菌落（圖1）劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板純培養(yǎng)，進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。①革蘭氏染色：?jiǎn)蝹€(gè)菌落經(jīng)革蘭氏染色后，為陽性桿菌，芽孢呈橢圓形，位于菌體中央，多呈短鏈或長(zhǎng)鏈狀排列（圖1）。②動(dòng)力培養(yǎng)：培養(yǎng)基中可疑菌落沿穿刺線呈擴(kuò)散生長(zhǎng)，與蕈狀芽孢桿菌“絨毛狀”生長(zhǎng)不同。③溶菌酶試驗(yàn)：在溶菌酶肉湯（含0.001%溶菌酶）中能生長(zhǎng)，溶液渾濁。④溶血試驗(yàn)：在TSSB瓊脂平板上可疑菌落呈淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有溶血環(huán)（圖2）。⑤根狀生長(zhǎng)試驗(yàn)：可疑菌落呈粗糙山谷狀生長(zhǎng)，蕈狀芽孢桿菌呈根狀生長(zhǎng)。⑥蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶：可疑菌落與蠟樣芽孢桿菌同樣無蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶（圖2）。

圖1 MYP培養(yǎng)基上的菌落和放大1 000X的革蘭陽性桿菌

圖2 溶血試驗(yàn)、根狀生長(zhǎng)試驗(yàn)、蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)

2.2.2 生化鑒定

分別挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落，用生化鑒定試劑盒對(duì)可疑菌落進(jìn)行生化鑒定，符合GB 4789.14—2014中蠟樣芽孢桿菌的生化特征，同時(shí)用VITEK 2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)鑒定可疑菌株與陽性蠟樣芽孢桿菌相似，為97%。

2.2.3 菌落計(jì)算

由上述的一系列鏡檢及生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果可得知，5份樣品中有1份樣品（編號(hào)為03）出現(xiàn)可疑菌落，共挑取6個(gè)菌落做生化鑒定，全部鑒定為蠟樣芽孢桿菌。各稀釋度蠟樣芽孢桿菌典型菌落數(shù)計(jì)數(shù)結(jié)果如表2所示。編號(hào)03組的兩個(gè)平行試驗(yàn)（03-1和03-2）只有10-3稀釋度的各平板菌落數(shù)在20～200 CFU，編號(hào)03-1的菌落數(shù)為（36+40+45）×6/6×103=1.2×105CFU·g-1；03-2的菌落數(shù)為（30+39+41）×6/6×103=1.1×105CFU·g-1，03 組 的 平 均 菌 落 數(shù) 為1.1×105CFU·g-1。

表2 蠟樣芽孢桿菌在MYP平板上的菌落計(jì)數(shù)

2.2.4 檢驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)MYP平板上的蠟樣芽孢桿菌的典型菌落數(shù)，報(bào)告03菌落數(shù)為T=1.1×105CFU·g-1，依據(jù)蠟樣芽孢桿菌食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則WS/T 82—1996判定該樣品中蠟樣芽孢桿菌為1.1×105CFU·g-1＞105CFU·g-1，由此可見編號(hào)03組速凍餡餅中的蠟樣芽孢桿菌數(shù)超過限量，會(huì)引起食用者食物中毒。

3 結(jié)論與討論

上述檢測(cè)結(jié)果顯示，385份預(yù)包裝食品中速凍餡餅和速凍餃子中檢出蠟樣芽孢桿菌，檢出率分別為5.17%、1.27%。由于餡餅及餃子的基質(zhì)是面粉、牛肉、豬肉，肉類及米面食品是人體生命活動(dòng)能量的主要來源，也非常適宜微生物的生長(zhǎng)和繁殖，一旦處理不當(dāng)就極易引起發(fā)食物中毒[9]。近些年，由食源性致病菌污染肉類食品和米面制品導(dǎo)致的食物中毒事件屢有發(fā)生，李光輝等[10]統(tǒng)計(jì)全國食物中毒特征分析，報(bào)道由微生物引起的食物中毒占比達(dá)38%～63%；江凱等[11]研究發(fā)現(xiàn)微生物因素引起的食物中毒占比達(dá)58%～72%；李可維等[12]對(duì)9 274份肉制品進(jìn)行食源性致病菌檢測(cè)，結(jié)果顯示致病菌檢出率最高為調(diào)理肉制品（混合類肉制品）。王霄曄等[13]、吳曉旻等[14]分析2018年全國食物中毒事件，由沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌等引起的細(xì)菌性食物中毒事件占總數(shù)的40%～69%，且多發(fā)生在學(xué)校、集體食堂和飲食服務(wù)單位。

蠟樣芽孢桿菌廣泛存在于自然界中，是一種常見的食源性條件致病菌，易引起嘔吐和腹瀉。本文速凍餡餅樣品中蠟樣芽孢桿菌檢出值為1.1×105CFU·g-1，超過一般安全隱患限值。還有文獻(xiàn)[15]提到食品中蠟樣芽孢桿菌含量在103～105CFU·g-1，食品具有一般安全隱患，即使炒制加熱等仍不能將殺滅該菌。有研究發(fā)現(xiàn)[16-18]在由蠟樣芽孢桿菌引發(fā)的食物中毒中，部分案例含菌量較少（如＜102CFU·g-1）。因此，低菌量的蠟樣芽孢桿菌污染也存在引發(fā)食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)引起重視。2018年，宋曉紅等[19]抽檢山西網(wǎng)絡(luò)訂餐194份，蠟樣芽孢桿菌檢出率最高，為13.9%，趙薇等[20]調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)百貨商場(chǎng)中蠟樣芽孢桿菌檢出率最高為32.4%，其次是小吃店及飲品店。這些場(chǎng)所所售食品具有快捷方便的特點(diǎn)，部分食品無需復(fù)熱和加熱可直接進(jìn)食。2019年史一等[21]指出山西食源性疾病主要集中在5—10月，食源性疾病發(fā)病季節(jié)性明顯，該季節(jié)濕熱致病菌生長(zhǎng)繁殖力強(qiáng)，人們會(huì)食用未高溫享調(diào)過或加熱不徹底的食品，若存在蠟樣芽孢桿菌污染，大大增加了感染食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。所以筆者建議居民短時(shí)間保存食物最好放置于冰箱中冷藏或冷凍，食用前微波加熱，養(yǎng)成良好的生活習(xí)慣。

本文檢測(cè)發(fā)現(xiàn)冷凍餡餅類食品檢出率較高，主要原因分析如下。①食品原材料存在污染風(fēng)險(xiǎn)。②混合餡料加工過程污染，主要是絞肉、斬拌等加工環(huán)節(jié)較多，人員、設(shè)備、工具和環(huán)境衛(wèi)生不達(dá)標(biāo)，可能造成交叉污染。③運(yùn)輸過程污染，未保持全程冷鏈。因此，食品企業(yè)和監(jiān)督部門應(yīng)加大和完善對(duì)食品原材料、生產(chǎn)、加工環(huán)節(jié)、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及銷售等各個(gè)環(huán)節(jié)的衛(wèi)生要求，加強(qiáng)對(duì)冷凍餡料食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)監(jiān)管，并納入抽檢規(guī)劃。提高監(jiān)測(cè)水平，增強(qiáng)消費(fèi)者食品安全風(fēng)險(xiǎn)防范意識(shí)，加強(qiáng)生產(chǎn)加工從業(yè)人員的衛(wèi)生意識(shí)培訓(xùn)，加強(qiáng)衛(wèi)生監(jiān)督及執(zhí)法力度。