黃 翠，單 宏*，李莉莉，梁溪桐，蘭 靜，張瑞英

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所，黑龍江哈爾濱 150086；2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，黑龍江哈爾濱 150086；3.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150086）

隨著社會的發(fā)展，人們生活水平的提高，人們對健康愈發(fā)重視，開始注重葷素搭配、營養(yǎng)均衡，喜食時(shí)令蔬菜。生菜作為即食蔬菜的一種，深受北方人們的喜愛，食用量很大[1]。但因其簡單清洗即可入口，本身可能存在食源性致病菌也引起了人們的擔(dān)憂[2]。受近年來食源性致病菌食品安全問題的影響[3]，為保障人們的身體健康，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部指導(dǎo)多地開展了即食果蔬中致病菌風(fēng)險(xiǎn)因子調(diào)查評估[4-5]。本文對2019—2021年哈爾濱市3個(gè)蔬菜種植基地種植的生菜及生長水土環(huán)境中常見細(xì)菌進(jìn)行了調(diào)查分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2019—2021年，分別采集哈爾濱市3個(gè)蔬菜基地7—8月份的大棚栽培綠葉生菜、紫葉生菜及水土環(huán)境樣品，采樣過程中佩戴無菌手套并將樣本置于無菌袋內(nèi)，立即送往實(shí)驗(yàn)室，當(dāng)日進(jìn)行檢測，3年樣本采集情況如表1所示。

表1 2019—2021年哈爾濱市蔬菜基地生菜及環(huán)境水土中樣本采集情況

1.1.2 儀器與試劑

（1）儀器。ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、拍擊式均質(zhì)器等。

（2）試劑。北京聚和美M5 GoldStar TaqMan Mixture聚合酶；北京陸橋生理鹽水、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）、緩沖蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）、亞硫酸鉍瓊脂（BS）、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂（XLD）、7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parker瓊脂、甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）、50%卵黃液、P-36E多黏菌素B、營養(yǎng)瓊脂、0.1%Chelex；所有試劑均在有效期內(nèi)。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)菌株

大腸埃希氏菌ATCC25922、沙門氏菌ATCC14028、金黃色葡萄球菌ATCC6538、蠟樣芽孢桿菌ATCC11778，均購自北京中原公司。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

（1）細(xì)菌的檢測。生菜及環(huán)境樣品中大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)依次參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》（GB 4789.3—2016）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4—2016）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》（GB 4789.10—2016）和《蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》（GB 4789.14—2014）進(jìn)行測定。澳大利亞等國對即食食品中微生物限量要求是大腸菌群數(shù)量小于104CFU·g-1，為可接受水平[6]；我國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《蠟樣芽胞桿菌食物中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)及處理原則》（WS/T 82—1996）對蠟樣芽孢桿菌數(shù)量的要求為大于105CFU·g-1的食品會引起食物中毒[7]。

（2）DNA提取及PCR反應(yīng)。挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落，加20 μL 0.1% Chelex，沸水浴5 min后，12 000 r·min-1離心5 min，取上清以備PCR反應(yīng)。參照《出口食品中食源性致病菌檢測方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》（SN/T 1870—2016）和《出口食品中蠟樣芽孢桿菌快速檢測方法-實(shí)時(shí)熒光定量PCR法》（SN/T 3932—2014）中引物序列，反應(yīng)體系及反應(yīng)程序。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 16.0軟件對兩個(gè)檢出率差異性做χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05。對于樣本量小于40的樣本做Fisher精確檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 哈爾濱市道里區(qū)蔬菜生產(chǎn)基地生菜和水土環(huán)境中細(xì)菌檢出情況

如表2、表3所示，2019—2021年共采集哈爾濱市3個(gè)蔬菜生產(chǎn)基地生菜和環(huán)境樣品270份。其中，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均未檢出。生菜中大腸菌群檢出率為60.00%（120/200），蠟樣芽孢桿菌檢出率為59.00%（118/200），紫葉生菜蠟樣芽孢桿菌檢出率高于綠葉生菜（90.24%＞50.94%，χ2=20.812，p＜0.05）。土壤中的大腸菌群與蠟樣芽孢桿菌檢出率高于生菜中（大腸菌群：94.29%＞60.00%，χ2=15.413，p＜0.05；蠟樣芽胞桿菌為100.00%＞59.00%，χ2=22.041，p＜0.05）。

表2 哈爾濱市蔬菜生產(chǎn)基地生菜樣本中4種常見細(xì)菌檢出情況

表3 生菜及環(huán)境樣本中常見細(xì)菌檢出率χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果

不同年份綠葉生菜中大腸菌群檢出率為2020年高于2019年（χ2=28.719，p＜0.05）、2021年（χ2=14.783，p＜0.05），2020年蠟樣芽孢桿菌檢出率高于2021年（χ2=9.752，p＜0.05）和 2019 年（χ2=25.297，p＜0.05），差異均為顯著。紫葉生菜中大腸菌群和蠟樣芽孢桿菌檢出率隨年份不同沒有顯著差異。

2.2 哈爾濱市道里區(qū)蔬菜生產(chǎn)基地生菜和水土環(huán)境中大腸菌群和蠟樣芽孢桿菌污染濃度情況

生菜及環(huán)境樣品中大腸菌群檢出濃度如表4所示。生菜中大腸菌群檢出濃度多集中在1 000～9 999 CFU·g-1，環(huán)境水中多集中在 10 ～ 99 CFU·g-1，土中多集中在100～999 CFU·g-1，均未超過104CFU·g-1。

表4 哈爾濱市道里區(qū)蔬菜生產(chǎn)基地生菜中大腸菌群污染濃度情況

生菜及環(huán)境樣品中蠟樣芽孢桿菌檢出濃度如表5所示。綠葉生菜蠟樣芽孢桿菌檢出范圍多在100～999 CFU·g-1，紫葉生菜多集中在1 000～9 999 CFU·g-1，環(huán)境水中多集中在 10 ～ 99 CFU·g-1，土中則集中在10 000～99 999 CFU·g-1，均未超過105CFU·g-1。

表5 哈爾濱市道里區(qū)蔬菜生產(chǎn)基地生菜及水土環(huán)境樣品中蠟樣芽孢桿菌污染濃度情況

3 討論

本文對2019—2021年哈爾濱市蔬菜生產(chǎn)基地中生菜及水土環(huán)境樣品中大腸菌群、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌污染情況進(jìn)行了調(diào)查，大腸菌群作為糞便污染的衛(wèi)生指標(biāo)菌，反映了生菜樣品的衛(wèi)生情況。參照澳大利亞等國對即食食品中微生物限量要求，大腸菌群數(shù)量小于104CFU·g-1，為可接受范圍，當(dāng)大腸菌群數(shù)量大于104CFU·g-1時(shí)，為不合格產(chǎn)品[6]。本次對哈爾濱市基地生菜的調(diào)查，大腸菌群的檢出率為60.00%，檢出濃度均未超過不合格濃度。沙門氏菌和金黃色葡萄球菌是兩種常見的致病菌，本次調(diào)查中均未檢出。在以往的研究中鮮有沙門氏菌在生菜中檢出的報(bào)道，而金黃色葡萄球菌在河南省[4]、浙江省[8]的生菜樣品中均有檢出的報(bào)道。本次金黃色葡萄球菌在生菜和種植環(huán)境樣本的調(diào)查中均未檢出，這可能與地域、氣候、環(huán)境或種植方式不同有關(guān)[9]。蠟樣芽孢桿菌為條件致病菌，當(dāng)蠟樣芽孢桿菌濃度到達(dá)105CFU·g-1時(shí)，可能引起食物中毒[7]，此次對哈爾濱市基地生菜的調(diào)查，蠟樣芽孢桿菌檢出率為59.00%，但檢出濃度均未超過105CFU·g-1?？傮w而言，雖然本次調(diào)查大腸菌群和蠟樣芽孢桿菌檢出比率較高，但檢出濃度并未超過風(fēng)險(xiǎn)濃度，但考慮到微生物隨溫度有一定的消長，紫葉生菜蠟樣菌定量分析，考慮其即食性，仍存在一定的食品安全隱患。

就不同年份來說，哈爾濱市基地綠葉生菜中大腸菌群檢出率2020年高于2019年和2021年，蠟樣芽孢桿菌檢出率2020年高于2021年和2019年，這可能與不同年份氣候條件變化有關(guān)[10]。就不同生菜類型講，紫葉生菜中蠟樣芽孢桿菌污染風(fēng)險(xiǎn)較綠葉生菜高，這可能與葉片中色素種類及含量不同或葉片的表面質(zhì)地不同對致病菌吸附能力不同有關(guān)[11]。對于種植環(huán)境水的調(diào)查，本文采集了剛抽取上來的地下水（哈爾濱蔬菜基地多以抽取地下水灌溉為主）、地表的殘水和水缸中殘留的雨水，發(fā)現(xiàn)大腸菌群與蠟樣芽孢桿菌檢出的樣品多為地表的殘水和水缸中殘留的雨水，而地下水基本未檢出，說明剛抽取上來的地下水相對較好。對于土壤的調(diào)查，本文采集了種植土，其大腸菌群與蠟樣芽孢桿菌檢出率與檢出濃度均較高，土壤中大腸菌群可能與農(nóng)家肥的施用有關(guān)，而土壤中含有較多的蠟樣芽孢桿菌芽孢[12]，并且土壤中蠟樣芽孢桿菌檢出率高于生菜，推測生菜中蠟樣芽孢桿菌污染可能來自土壤，這一觀點(diǎn)與劉一倩等[13]的研究相同。

目前，國內(nèi)外尚未有初級農(nóng)產(chǎn)品中衛(wèi)生指標(biāo)菌與致病菌限量標(biāo)準(zhǔn)。已經(jīng)實(shí)施的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[14]中僅規(guī)定了即食果蔬制品中致病菌限量，即將實(shí)施的《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607—2021）[15]中有蠟樣菌限量規(guī)定，雖僅限米制品，也可借鑒參考。廣東省2016年頒布了食品安全地方標(biāo)準(zhǔn)《非預(yù)包裝即食食品微生物限量》（DBS 44/006—2016），標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定去皮或預(yù)切的果蔬或果蔬食品中，沙門氏菌不得檢出，大腸埃希氏菌超過102CFU·g-1，金黃色葡萄球菌超過104CFU·g-1，蠟樣芽孢桿菌超過105CFU·g-1，為不合格樣品[16]。我國農(nóng)產(chǎn)品中食源性致病菌風(fēng)險(xiǎn)評估工作起步較晚，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)不充分，農(nóng)產(chǎn)品中風(fēng)險(xiǎn)因子不清，來源不明，鑒于近年來國際上由致病菌引發(fā)的食品安全事件時(shí)有發(fā)生[17-18]，而國際間往來頻繁，國際貿(mào)易持續(xù)增長，存在食源性致病菌傳入我國的風(fēng)險(xiǎn)，因此建議加大對我國農(nóng)產(chǎn)品，尤其是即食果蔬中致病菌風(fēng)險(xiǎn)評估的力度，充實(shí)數(shù)據(jù)，保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，確保我國出口果蔬的產(chǎn)品質(zhì)量，提升我國農(nóng)產(chǎn)品在國際市場上的地位[19]。同時(shí)，加快推進(jìn)實(shí)施良好農(nóng)業(yè)操作規(guī)范、良好生產(chǎn)規(guī)范和良好衛(wèi)生規(guī)范在內(nèi)的管理體系，完善生產(chǎn)、運(yùn)輸和銷售產(chǎn)業(yè)鏈管理體系也能有效減少病原微生物的污染和傳播[20-21]。