史亞男 胡志娟 王利軍 董春霞 馮珍 劉冰

(河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

糖尿病(DM)引發(fā)的并發(fā)癥DM性腎病(DN)是DM的重要致死原因之一〔1〕?；颊呶⒀懿∽冏罱K導(dǎo)致腎衰竭。我國DN患者達到0.6億，占DM患者的40%以上，尿毒癥患者中約17%是由DN所致〔2，3〕。由于DN的病因和發(fā)病機制相當(dāng)復(fù)雜，目前認為與糖代謝紊亂、血流動力學(xué)改變、細胞因子、遺傳易感性等有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在DM大鼠中，Ghrelin在遠曲小管及集合管均有表達，且隨時間延長，表達強度增加。提示Ghrelin在DN發(fā)生的病理生理機制中可能起一定作用，Ghrelin升高可能是一種保護性反應(yīng)。國內(nèi)外僅有采用免疫組化的方法，觀察Ghrelin在STZ誘導(dǎo)的DM大鼠腎臟表達的報道〔4〕，目前國內(nèi)尚無Ghrelin在DN方面的研究。本文旨在建立大鼠DN模型，應(yīng)用氯沙坦進行干預(yù)，觀察Ghrelin與DN大鼠疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與材料

1.1實驗動物 54只清潔級健康雄性SD大鼠，體重300～350 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗室，于河北省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗中心飼養(yǎng)。于模型制備前讓大鼠適應(yīng)環(huán)境7 d，自由進食，不限飲水，溫度22～26℃，濕度40%～70%。

1.2材料 空腹血糖(FPG)、血脂、血肌酐、尿素氮生化試劑盒購于南京建成生物工程研究所；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒購于碧云天生物技術(shù)公司；STZ購于Sigma；酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)購于聯(lián)世生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1DM模型的建立〔5〕及分組給藥 模型建立 ①大鼠經(jīng)普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，選擇健康、狀態(tài)良好、血糖正常的大鼠列入觀察。②所有大鼠禁食12 h，給予單次腹腔注射單劑量STZ 65 mg/kg，(STZ臨用前溶解于0.1 mol/L、pH4.5的檸檬酸鹽緩沖液)，注射STZ 72 h后，尾靜脈采血，以血糖高于16.7 mmol/L者，視為DM大鼠造模成功。DN造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：尿量>原尿量150%，尿蛋白排泄率>30 mg/(mmol·Cr)。分組及給藥：將成模的大鼠隨機分為DN模型組(DN組)、DN+氯沙治療組(氯沙坦組：造模后每日早晨給予默沙東公司生產(chǎn)的氯沙坦30 mg/kg灌胃1次)。氯沙坦組日常給予高脂飲食喂養(yǎng)。另選18只正常大鼠作為對照組，對照組和DN組日常予以等量緩沖液灌胃。

1.3.2Ghrelin測定 各組于給藥后第12周末禁食不禁水10 h，以0.33 ml/L 100 g體重腹腔注射10%水合氯醛麻醉動物。心臟取血標(biāo)本約3 ml。其中1 ml中加入預(yù)冷的乙二胺四乙酸(EDTA)1 mg、抑肽酶70 μg混勻，4℃，3 000 r/min離心15 min，取上清-20℃貯存，用于Ghrelin測定；其余直接離心得血清，-20℃貯存，用于FPG、血脂、血肌酐測定。

1.3.3ELISA 將約100 mg腎組織加入100 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液中，勻漿取上清，-20℃過夜，反復(fù)凍融2次后5 000 r/min離心5 min。測定腫瘤壞死因子(TNF)-6、白細胞介素(IL)-6、IL-1β水平。

1.3.4尿樣收集 各組處死前單獨放置于代謝籠中，禁食不禁水，收集24 h尿液后，2 000 r/min離心10 min，棄沉渣后分裝于EP管中，-80℃保存。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件行χ2、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.13組體重、24 h尿量、尿蛋白比較 與對照組比較，DN組體重顯著下降(P<0.05)；與DN組比較，氯沙坦組體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。與對照組比較，DN組24 h尿量、尿蛋白水平均顯著升高(P<0.05)；與DN組比較，氯沙坦組24 h尿量及尿蛋白水平均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組體重、24 h尿量、尿蛋白水平比較

2.23組血糖、血清肌酐、尿素氮水平比較 與對照組比較，DN組FPG、血肌酐、尿素氮水平均顯著升高(P<0.05)；與DN組比較，氯沙坦組血肌酐、尿素氮水平均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 3組血糖、血清肌酐、尿素氮水平比較

2.33組腎組織病理學(xué)變化 對照組可見鮑氏囊正常的腎小球，腎小球內(nèi)未見空泡。DN組可見鮑氏囊皺縮的腎小球，腎小球空泡化，可見炎性浸潤。氯沙坦組可見鮑氏囊輪廓縮小的腎小球，腎小球結(jié)構(gòu)受損，空泡數(shù)量少。見圖1。

圖1 3組腎組織病理學(xué)變化(HE染色，×400)

2.43組腎組織中炎癥因子比較 與對照組比較，DN組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著升高(P<0.05)；與DN組比較，氯沙坦組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著降低(P<0.05)。見表3。

2.53組腎組織中纖維化指標(biāo)水平比較 與對照組比較，DN組轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1、纖維連接蛋白(FN)水平均顯著升高(P<0.05)；與DN組比較，氯沙坦組TGF-β1、FN水平均顯著降低(P<0.05)。見表3。

2.63組血清Ghrelin、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB水平比較 與對照組比較，DN組Ghrelin水平顯著降低，NF-κB水平顯著升高(P<0.05)；與DN組比較，氯沙坦組Ghrelin水平顯著升高，而NF-κB水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 3組腎組織中炎癥因子、纖維化指標(biāo)及血清Ghrelin、NF-κB水平比較

3 討 論

我國年齡標(biāo)準(zhǔn)化的DM發(fā)病率已高達10%〔6〕，DN最終導(dǎo)致患者致殘、致死。國內(nèi)外采用各種藥物進行綜合治療，但只能緩解患者腎功能減退〔7〕，研究報道Ghrelin可激活膿毒血癥大鼠模型的膽堿能通道，從而抑制促炎因子的表達，減輕胃腸道炎癥〔8〕。Ghrelin為生長激素促分泌素受體，有免疫功能〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，Ghrelin在關(guān)節(jié)滑液中表達水平〔10〕和炎癥標(biāo)志物TNF-α、IL-6的表達水平呈負相關(guān)。研究證實信號通路NF-κB對于調(diào)控炎癥介質(zhì)的表達有重要作用，在NF-κB的經(jīng)典激活過程中，IκBα被磷酸化、繼而降解，進而調(diào)控包括TNF-α、IL-6、IL-1β等多種促炎因子的轉(zhuǎn)錄〔11〕。研究也發(fā)現(xiàn)，膿毒癥大鼠NF-κB活性升高，Ghrelin干預(yù)后，NF-κB活性下降〔12〕。提示Ghrelin或許通過降低膿毒癥大鼠信號通路NF-κB活性而降低促炎因子的表達〔13,14〕。研究表明NF-κB在DN大鼠腎組織中含量高，且其表達水平與腎組織炎癥反應(yīng)及腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化相關(guān)，因此NF-κB很可能是導(dǎo)致腎臟微炎癥和間質(zhì)纖維化的激活通路〔15〕。

關(guān)于Ghrelin對DN腎臟炎癥確切機制還有待進一步研究。對DN機制的研究越明確深入，越有利于尋找腎臟保護的有效治療途徑，為以后臨床預(yù)防和治療DN腎損傷提供重要的參考依據(jù)。