周冬玉，李國紅，靳澤華，徐巧霞，徐蓉，張安定，5*

（1．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；2．湖北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430070；3．農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)診斷制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070；4．武漢科前生物股份有限公司，湖北武漢 430070；5．科技部動(dòng)物疫病聯(lián)合研究中心，湖北武漢 430070）

馬立克氏?。∕D）是由馬立克氏病病毒（MDV）引起的一種高度傳染性淋巴組織增生性腫瘤病，發(fā)病率和病死率均較高。MDV是一種嚴(yán)格的細(xì)胞結(jié)合型病毒，可根據(jù)血清學(xué)反應(yīng)分為MDV-Ⅰ型、MDV-Ⅱ型、MDV-Ⅲ型，但只有Ⅰ型具有致病性[1-2]。20世紀(jì)70年代，國際上開始采用火雞皰疹病毒（HVT）苗預(yù)防MD[3]；20世紀(jì)80～90年代起，MDV開始朝毒力更強(qiáng)的方向進(jìn)化[4]，MD的疫苗也隨之增加。但超強(qiáng)毒株突破了CVI988以及814疫苗毒株的保護(hù)力造成免疫失敗[5]，造成多種病原的繼發(fā)及共同感染。因此，及時(shí)診斷對(duì)MD防控具有重大意義。

MDV是雙鏈DNA分子，基因組約180 kb，由2個(gè)單鏈環(huán)通過一個(gè)雙鏈臂連接而成，包括末端長(zhǎng)短重復(fù)序列以及內(nèi)部長(zhǎng)短重復(fù)序列[6]。MDV基因組上功能區(qū)域可分為主要致瘤基因meq[7]、與毒株毒力相關(guān)的132-bp重復(fù)序列[8]、與免疫抑制相關(guān)的pp38/pp24磷蛋白基因[9]、與免疫逃避相關(guān)的v-il8基因[10]以及1.8 kb基因家族[9-11]；與誘導(dǎo)免疫應(yīng)答相關(guān)的糖蛋白基因gB、gC、gD、gE等；尚未闡述清楚功能的其他基因。運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)[12]、黏粒和BAC克隆等技術(shù)[13]構(gòu)建的meq基因缺失毒株的致瘤性明顯減弱，表明meq基因作為致瘤基因在MDV腫瘤形成發(fā)展過程中具有至關(guān)重要的作用[14]。試驗(yàn)對(duì)Gen Bank發(fā)表的140余株MDV序列進(jìn)行全基因組比對(duì)，選定MDV-Ⅰ型特有的meq基因設(shè)計(jì)1對(duì)引物，通過優(yōu)化退火溫度等條件建立了MDV-Ⅰ的PCR診斷方法，評(píng)估該方法的特異性、靈敏度及重復(fù)性，以期為MD的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

MD病死雞的肝組織分離自某雞場(chǎng)。

MDV-Ⅰ型毒株、CVI988、814疫苗毒株均由武漢科前生物股份有限公司饋贈(zèng)。HVT、雞傳染性貧血病毒（CIAV）、雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）、雞傳染性法氏囊病毒（IBDV）、禽白血病病毒（ALV）、雞包涵體肝炎病毒（IBHV）、禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

EasyTaq?DNA Polymerase（北京全式金生物技術(shù)有限公司）；DNAiso Reagent試劑盒（寶生物工程（大連）有限公司）。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)全基因組比對(duì)以及Gen Bank上發(fā)表的meq基因設(shè)計(jì)1對(duì)引物meq-F及meq-R，引物由北京擎科生物科技有限公司武漢分公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequence of primers

1.3 PCR擴(kuò)增

1.3.1 樣品基因組制備

復(fù)蘇CEF細(xì)胞，將MDV接種于CEF細(xì)胞，待細(xì)胞病變約為70%時(shí)收取細(xì)胞，采用DNAiso Reagent試劑盒提基因組。取部分疑似MD病死雞的肝組織，剪碎成米粒大小的組織塊，提取基因組的同時(shí)提取CVI988、814、CIAV、IBV、IBDV、ALV、IBHV、IAV、NDV、CEF細(xì)胞基因組。

1.3.2 PCR診斷方法的建立

擴(kuò)增體系（總體積為25 μL）：以1.3.1中提取的MDV-Ⅰ型毒株以及CVI988、814、HVT疫苗毒株基因組為模板，各 取1 μL；EasyTaq?-DNA Polymerase 0.5 μL、10×EasyTaq?-buffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL、上游引物和下游引物各1 μL（10 μmol/L）。

擴(kuò)增程序：?jiǎn)握羲a(bǔ)足至總體系為25 μL，設(shè)置35個(gè)循環(huán)數(shù)，95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，62℃退火5 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min，4℃保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析以及測(cè)序分析。

1.3.3 PCR特異性試驗(yàn)

采用1.3.1中提取的MDV-Ⅰ型毒株、814疫苗毒株、CIAV、IBV、IBDV、ALV、IBHV、IAV、NDV、CEF基因組為模板，運(yùn)用確定的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，評(píng)估其特異性。

1.3.4 PCR敏感性試驗(yàn)

將1.3.1中提取的MDV-Ⅰ型毒株、814疫苗毒株、CEF基因組進(jìn)行NANO DROP定量，調(diào)整至終濃度為10 g/mL后，做10倍比稀釋，連續(xù)稀釋5個(gè)梯度為模板（10.000、1.000、0.100、0.010、0.001 g/mL），以反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，判斷其敏感性。

1.3.5 PCR重復(fù)性試驗(yàn)

將1.3.1中的MDV-Ⅰ型毒株、CVI988、814疫苗毒株、CEF基因組進(jìn)行PCR檢測(cè)，每個(gè)模板設(shè)置3次重復(fù)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，評(píng)估穩(wěn)定性。

1.3.6 對(duì)1例疑似免疫失敗雞的檢測(cè)

以MDV-Ⅰ型毒株、814疫苗毒株、疑似MD病死雞肝組織基因組、CEF基因組為模板，運(yùn)用確定的PCR條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析后送測(cè)序判斷檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR診斷方法（見圖1～圖3）

由圖1可知，MDV-Ⅰ型毒株基因組擴(kuò)增得到286 bp條帶，CVI988、814疫苗毒株擴(kuò)增得到463 bp條帶，HVT疫苗毒株未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶。

圖1 MDV PCR診斷方法Fig.1 Diagnostic method of PCR for MDV

將擴(kuò)增條帶送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示MDV-Ⅰ型毒株擴(kuò)增條帶與MDV-Ⅰ型毒株基因序列匹配（見圖2）；疫苗毒株擴(kuò)增條帶與疫苗毒株基因序列匹配（見圖3）。

圖2 MDV-Ⅰ測(cè)序結(jié)果Fig.2 Sequence results of MDV-Ⅰ

圖3 MDV疫苗毒株測(cè)序結(jié)果Fig.3 Sequence results of MDV vaccine virus

2.2 MDV PCR檢測(cè)特異性試驗(yàn)結(jié)果（見圖4）

由圖4可知，MDV-Ⅰ型毒株基因組擴(kuò)增得到286 bp條帶，CVI988、814疫苗毒株擴(kuò)增得到463 bp條帶，其他均未擴(kuò)增出條帶。結(jié)果表明，研究建立的PCR方法能夠特異性擴(kuò)增MDV-Ⅰ型毒株和疫苗毒株，并對(duì)二者進(jìn)行區(qū)分。

圖4 MDV PCR檢測(cè)特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Specificity test of PCR for MDV

2.3 PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果（見圖5、圖6）

由圖5、圖6可知，以MDV-Ⅰ型毒株基因組PCR擴(kuò)增為模板的檢測(cè)下限為0.010 g/mL，以814疫苗毒株基因組PCR擴(kuò)增為模板的檢測(cè)下限為0.010 g/mL，表明本研究建立的PCR方法存在較高敏感性，適用于MDV檢測(cè)。

圖5 MDV-ⅠPCR檢測(cè)敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Sensitivity test of PCR for MDV-Ⅰ

圖6 814 PCR檢測(cè)敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.6 Sensitivity test of PCR for 814

2.4 PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（見圖7）

由圖7可知，3次試驗(yàn)結(jié)果一致且均擴(kuò)增出與預(yù)期相符的條帶，表明研究建立的PCR方法具有良好的重復(fù)性。

圖7 MDV PCR檢測(cè)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Repetitive test result of PCR for MDV

2.5 對(duì)1例免疫失敗雞的檢測(cè)（見圖8～圖10）

圖8 MDV免疫失敗試驗(yàn)結(jié)果Fig.8 MDV immune failure test result

圖10 免疫失敗雞MDV疫苗毒株測(cè)序結(jié)果Fig.10 Sequencing result of MDV vaccine virus in immune-failed chickens

由圖8可知，可擴(kuò)增得到286、463 bp條帶，分別與野毒株、疫苗毒株大小符合。

由圖9、圖10可知，擴(kuò)增序列與MDV-Ⅰ型毒株和疫苗毒株的序列匹配，確診該疑似MD病死雞為免疫失敗。

圖9 免疫失敗雞MDV-Ⅰ測(cè)序結(jié)果Fig.9 Sequencing result of MDV-Ⅰin immune-failed chickens

3 討論

本研究經(jīng)MDV全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，CVI988、814疫苗毒株的meq基因相較于MDV-Ⅰ型毒株插入了177 bp的堿基。本研究基于meq基因177 bp插入處，設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用該引物以MDV-Ⅰ型毒株為模板可擴(kuò)增得到286 bp的片段，以CVI988、814疫苗毒株為模板可擴(kuò)增得到463 bp的片段，診斷MDV-Ⅰ型并鑒別其與疫苗毒株；通過特異性試驗(yàn)、敏感性試驗(yàn)以及重復(fù)性試驗(yàn)評(píng)估，表明該方法特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性穩(wěn)定。應(yīng)用該方法檢測(cè)1例接種過疫苗但感染疑似MDV-Ⅰ型毒株病死雞組織，可同時(shí)擴(kuò)增得到約463和286 bp的片段；2個(gè)片段測(cè)序結(jié)果與預(yù)期序列相符，確診該病死雞為免疫失敗造成的死亡。本試驗(yàn)建立的MDV PCR診斷方法應(yīng)用于臨床實(shí)踐中可及時(shí)對(duì)雞群進(jìn)行MD防控，保障養(yǎng)禽業(yè)的健康發(fā)展。

MDV不斷變異，其毒力也不斷增強(qiáng)。為研制預(yù)防MDV超強(qiáng)毒株的疫苗，Su等[15]研究中構(gòu)建了meq基因缺失株GX0101Δmeq，并篩選獲得了具有良好復(fù)制能力且在一定程度上能夠有效控制超強(qiáng)MDV的SC9-1候選疫苗株，但仍需大量的臨床數(shù)據(jù)驗(yàn)證該疫苗候選株的安全性。劉長(zhǎng)軍等[16]分別通過兩次同源重組構(gòu)建了meq基因缺失中間體病毒毒株與meq基因缺失疫苗株rMS△meq，在該研究中構(gòu)建的重組病毒同樣具有良好的免疫保護(hù)效力。目前市場(chǎng)上廣泛采用的CVI988和814疫苗毒株在最近幾年頻繁出現(xiàn)免疫失敗的情況[17]。因此，能夠及時(shí)、準(zhǔn)確地診斷MD并對(duì)MDV-Ⅰ型毒株和疫苗毒株進(jìn)行區(qū)分至關(guān)重要。本研究建立的PCR檢測(cè)方法能夠區(qū)分MDV-Ⅰ型毒株和現(xiàn)有的CVI988和814疫苗毒株及SC9-1疫苗株和meq基因缺失疫苗株rMS△meq。

MD疫苗免疫失敗還可能存在的原因是雛雞早期感染CIAV、禽網(wǎng)織內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）等免疫抑制病破壞雞群的免疫功能。MD感染雞群常常和ALV、CIAV、REV等共同感染[18-19]，CIAV和REV均可抑制馬立克氏病疫苗的免疫應(yīng)答，使MDV在感染雞體內(nèi)不斷增殖[20-21]，導(dǎo)致MD的嚴(yán)重性和影響性進(jìn)一步擴(kuò)大。本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法能夠特異性擴(kuò)增MDV-Ⅰ型毒株和疫苗毒株，對(duì)CIAV、ALV、IBV、IBDV、IBHV、IAV、NDV均無擴(kuò)增，展現(xiàn)出較高的特異性。本試驗(yàn)建立的MDV診斷方法特異性好、敏感性高、重復(fù)性穩(wěn)定，適用于臨床應(yīng)用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)建立的MDV-Ⅰ的PCR診斷方法可快速有效地診斷MD，區(qū)分MDV-Ⅰ和疫苗毒株，篩選免疫失敗的雞群，為快速診斷和區(qū)分MD提供了參考。