梁莉，趙磊，牛慶奎，孔垂彬，車傳燕，馬百鎖，魏煥巍

（1．山東蔚藍生物科技有限公司青島分公司，山東青島 266101；2．山東蔚藍生物科技有限公司，山東濱州 251700）

丁酸梭菌是一種在厭氧條件下生長的微生物，是芽孢桿菌科梭菌屬的一種革蘭氏陽性菌，于2009年被批準為新飼料添加劑，開始應用于國內市場[1]。丁酸梭菌生長過程中代謝產(chǎn)生了乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等多種有機酸[2-3]，其中丁酸對腸道上皮組織的再生修復具有重要意義[4-5]。丁酸可修復腸黏膜，降低腸道pH值，而較低的腸道pH值更適合益生菌生長增殖[6-7]。王康莉[8]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌及其代謝產(chǎn)物可顯著提高斷奶仔豬空腸絨毛高度，減少炎癥因子分泌，并通過調節(jié)腸道微生物區(qū)系維持腸道健康。

目前，丁酸梭菌在肉雞養(yǎng)殖方面多采用活菌粉飼喂的方式進行試驗。如Zeng等[9]開展了丁酸梭菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌復合益生菌粉（1010～1011CFU/kg）飼喂試驗，發(fā)現(xiàn)肉雞末重和血清總蛋白顯著增加。Takahashi等[10]研究發(fā)現(xiàn)，以丁酸梭菌MIYAIRI 588（2.5×105CFU/g）飼喂肉雞，可使平均日增重提高2%，肉雞生長性能得到顯著改善。丁酸梭菌代謝產(chǎn)物對肉雞生長的影響研究較少，且基于菌液方便用于飲水的因素考慮，本試驗通過進行丁酸梭菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化，并進行飲水試驗評價其對肉雞生長性能的影響，為高丁酸含量的丁酸梭菌液在肉雞養(yǎng)殖中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

丁酸梭菌為山東蔚藍生物科技有限公司保藏菌種。

主要試劑：強化梭菌培養(yǎng)基（北京陸橋技術股份有限公司）；可溶性淀粉、一水葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；酵母粉、蛋白胨（均為試驗用生化試劑，OXOID公司）；乳酸、乙酸、丙酸、正丁酸、正己酸（均為試驗用色譜試劑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

主要儀器：潔凈工作臺（青島海爾生物醫(yī)療公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；L530型離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；Waters-2695型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 丁酸梭菌活化擴培

吸取甘油管中保存的丁酸梭菌液500 μL，接種于100 mL滅菌的強化梭菌培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，獲得丁酸梭菌擴培菌液。

1.2.2 丁酸梭菌發(fā)酵液制備

可溶性淀粉10 g/L、葡萄糖10 g/L、K2HPO45 g/L、KH2PO4 0.1 g/L、酵母粉15 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L、pH值為7.0±0.1。接種量為5%，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，10 000 r/min離心10 min，取上清。

1.2.3 丁酸梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁酸優(yōu)化單因素試驗

選擇培養(yǎng)基的碳源、氮源、發(fā)酵初始pH值開展單因素試驗。在其他組分和培養(yǎng)條件不變的前提下，分別以可溶性淀粉、葡萄糖、酵母粉、初始pH值進行單因素試驗研究。單因素試驗設計見表1。

表1 單因素試驗設計Tab.1 Single factor test design

1.2.4 丁酸梭菌發(fā)酵產(chǎn)丁酸優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以可溶性淀粉（A）、葡萄糖（B）和發(fā)酵初始pH值（C）為研究對象，采用L9（34）正交試驗優(yōu)化丁酸梭菌發(fā)酵條件，通過極差分析和SPSS方差分析[11]，確定該菌代謝分泌丁酸的發(fā)酵最優(yōu)條件。L9（34）正交試驗因素水平設計見表2。

表2 L9（34）正交試驗因素水平設計Tab.2 L9(34)orthogonal test factor levels design

1.2.5 高效液相色譜（HPLC）定量檢測有機酸

Waters-2695型高效液相色譜儀，檢測器為紫外檢測器，kc-811色譜柱。

丁酸梭菌離心上清液，經(jīng)過0.1 μm的水系濾膜過濾進行有機酸測定。測定條件為：流速0.8 mL/min；柱溫40℃；波長210 nm；流動相：0.1%磷酸水溶液。

1.2.6 飲水添加丁酸梭菌液對肉雞生長性能的影響

選取150只健康1日齡白羽肉雞，隨機分為3組，每組5個重復，每個重復10只雞，開展42 d的飲水試驗評價，試驗設計見表3。基礎日糧采用玉米-豆粕型日糧，日糧配方設計參考《雞飼養(yǎng)標準》（NY/T 33—2004），基礎日糧組成及營養(yǎng)水平見表4。

表3 飲水試驗設計Tab.3 Drinking water trial design

表4 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平Tab.4 Basic diet composition and nutritional level

試驗開始第1 d和結束第2 d，以重復為單位空腹稱重（稱重前12 h斷料），統(tǒng)計耗料量，計算平均日增重、平均日采食量和料重比。每日早、晚觀察試驗雞的健康狀況。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進行初步整理，SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 有機酸標準品色譜圖（見圖1）

圖1 有機酸標準品色譜圖Fig.1 Organic acid standard chromatogram

由圖1可知，乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和己酸的保留時間為10.359、11.953、13.695、16.385、33.356。各組分峰形良好，基線穩(wěn)定，該方法可應用于上述有機酸的檢測。

2.2 丁酸梭菌初始發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酸情況分析（見表5）

由表5可知，丁酸梭菌經(jīng)過液體發(fā)酵，主要代謝產(chǎn)生了乳酸、乙酸和丁酸等3種有機酸，含量分別為0.414、1.441、2.803 g/L，丙酸和己酸產(chǎn)生較少，活菌計數(shù)為1.05×108CFU/mL。

表5 丁酸梭菌初始發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酸情況分析Tab.5 Analysis of acid production in initial fermentation medium of Clostridium butyricum 單位：g/L

2.3 丁酸梭菌發(fā)酵優(yōu)化單因素試驗結果（見圖2）

由圖2可知，隨著可溶性淀粉含量提高，代謝物丁酸產(chǎn)量升高；當可溶性淀粉含量為20 g/L時，產(chǎn)生的丁酸含量達到最高；之后繼續(xù)提高可溶性淀粉含量，產(chǎn)生的丁酸含量略有降低。

圖2 丁酸梭菌發(fā)酵優(yōu)化單因素試驗結果Fig.2 Single factor test result of fermentation optimization of Clostridium butyricum

當葡萄糖含量達到10 g/L時，代謝產(chǎn)生的丁酸含量最高。隨著酵母粉含量增加，代謝產(chǎn)物變化平緩，其原因可能是現(xiàn)有的酵母粉添加量已滿足試驗需求，再提高其含量對發(fā)酵幫助不大。

當發(fā)酵初始pH值在6.0～7.5范圍內時，代謝產(chǎn)生的丁酸含量有所不同；當pH值在7.0的中性條件時，代謝物產(chǎn)量最高；pH值達到8.0時，代謝物丁酸含量極少，該pH值條件下不適于丁酸梭菌生長。

綜上所述，進一步選擇可溶性淀粉、葡萄糖和發(fā)酵初始pH值進行正交試驗優(yōu)化。

2.4 丁酸梭菌發(fā)酵優(yōu)化正交試驗結果（見表6、表7）

發(fā)酵其他條件不變，經(jīng)過對培養(yǎng)基中可溶性淀粉、葡萄糖和發(fā)酵初始pH值的正交試驗優(yōu)化。

由表6可知，通過極差分析，菌體發(fā)酵代謝生成丁酸的影響因素由大到小依次為A＞B＞C。最優(yōu)組合為A2B2C3，即可溶性淀粉20 g/L、葡萄糖10 g/L、初始pH值為7.5。

表6 L9（34）正交試驗結果Tab.6 L9(34)orthogonal test result

由表7可知，通過SPSS進行方差分析，結果與極差分析一致，可溶性淀粉和葡萄糖對代謝產(chǎn)酸具有顯著影響（P＜0.05）。根據(jù)正交試驗獲得的產(chǎn)丁酸的最優(yōu)組合A2B2C3進行驗證試驗，丁酸含量為8.050 g/L，活菌計數(shù)為1.27×108CFU/mL；經(jīng)過正交試驗優(yōu)化，丁酸梭菌代謝丁酸的水平與初始發(fā)酵培養(yǎng)基相比提高了2.87倍。

表7 L（934）正交試驗結果方差分析Tab.7 L9(34)orthogonal test optimization and result analysis

2.5 飲水添加丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響（見表8）

由表8可知，1～21日齡，與對照組相比，試驗組1和試驗組2肉雞的腹瀉率顯著降低（P＜0.05）。22～42日齡，與對照組相比，試驗組1和試驗組2肉雞的料重比和腹瀉率均顯著降低（P＜0.05）；且試驗組2腹瀉率最低，顯著低于試驗組1（P＜0.05）。1～42日齡，與對照組相比，試驗組1和試驗組2肉雞的料重比和腹瀉率均顯著降低（P＜0.05）；且試驗組2腹瀉率最低，顯著低于試驗組1（P＜0.05）。

表8 飲水添加丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響Tab.8 Effect of Clostridium butyricum supplementation in drinking water on growth performance of broilers

綜上所述，在42 d飼喂試驗中，與對照組相比，試驗組2肉雞的料重比和腹瀉率有所改善，效果顯著。

3 討論

3.1 丁酸梭菌發(fā)酵產(chǎn)酸優(yōu)化

丁酸梭菌可提高動物生長性能和免疫功能[12]，發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生乳酸、乙酸和丁酸等多種有機酸，其中乳酸和乙酸常用于降低飼料pH值[13]，減少飼料中腐壞微生物污染[14]。代謝產(chǎn)物丁酸在腸道上皮細胞的再生和修復中發(fā)揮著重要作用，提高菌株發(fā)酵液中代謝產(chǎn)生丁酸的水平有助于提升該菌應用過程中的益生作用。傅云扉等[15]綜述了丁酸梭菌基因工程改造進展，旨在探索分子水平改造提高產(chǎn)丁酸代謝能力的新思路。本文采用發(fā)酵工程技術方法，對發(fā)酵原料和發(fā)酵參數(shù)控制的正交優(yōu)化，獲得了此株丁酸梭菌更高效發(fā)酵分泌丁酸的培養(yǎng)基；經(jīng)發(fā)酵驗證，搖瓶發(fā)酵液中丁酸含量提高到8.050 g/L，高于張楠等[16]發(fā)酵的丁酸7.3 g/L的含量。

3.2 丁酸梭菌對肉雞生長性能的影響

鄭愛娟等[17]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加2.5×108CFU/kg丁酸梭菌菌粉可顯著提高42日齡肉雞血清總蛋白、白蛋白和球蛋白的含量，促進家禽對飼料的利用，提高機體營養(yǎng)物質的吸收，提高肉雞生長性能。徐明霞[18]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加400 g/t丁酸梭菌改善肉雞生長性能的效果最佳，試驗組肉雞的末重顯著高于空白對照組，與本試驗中試驗組2肉雞末重最高的結論一致。

本試驗采用丁酸梭菌發(fā)酵的菌液進行飲水試驗，除活菌外還含有多種代謝產(chǎn)物有機酸，尤其試驗組2的菌液經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化，對肉雞的腹瀉率具有顯著的改善作用。原因可能是其產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的能力，可調節(jié)腸道pH值，抑制病原菌，從而調整細菌群落結構[19]。Verma等[20]研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌可提高乳酸菌的相對豐度，乳酸菌可預防試驗模型動物的結腸炎癥發(fā)生，緩解腹瀉情況。

4 結論

近年來，飼用丁酸梭菌的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)展迅速，極大地促進了其在動物養(yǎng)殖業(yè)中的推廣。丁酸梭菌發(fā)酵過程代謝產(chǎn)生的丁酸對動物的益生性能突出，不僅可保護腸道功能，還利于平衡腸道微生物菌群。本試驗借助HPLC定量分析方法，提高了飼用丁酸梭菌代謝生產(chǎn)丁酸的水平；在飲水試驗中，含有丁酸8.050 g/L的菌液可顯著改善肉雞生長性能，利于動物養(yǎng)殖的腸道健康，也可助力綠色生態(tài)養(yǎng)殖的發(fā)展。