馬子豪，向軍，紀(jì)曉嵐，廖慶艷，張福梅，周雪雁，3*

（1．西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730124；2．西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730030；3．西北民族大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅蘭州 730030）

我國畜禽血液年產(chǎn)量可達(dá)1.9×109kg，其中含有蛋白 3.6×108kg。原料血液不易儲藏、易污染、口感差等特點(diǎn)嚴(yán)重制約了畜禽血液的利用，傳統(tǒng)的掩埋、焚燒等物理方法無法很好地利用血液資源，還造成了環(huán)境污染[1]。國內(nèi)外普遍采用噴霧干燥、蒸煮干燥等方法將血液加工成血粉，并通過酸堿水解、微生物發(fā)酵、酶解等方法將其中的蛋白質(zhì)分解為可利用的肽和氨基酸[2]。2001年，《禁止在反芻動物飼料中添加和使用動物性飼料的通知》明文規(guī)定禁止在反芻動物飼料中使用動物性飼料，動物性飼料的使用量大幅降低，嚴(yán)重制約了家畜血液的利用。微生物法降解廢棄血液是目前公認(rèn)的血液綜合利用的研究方向。微生物法處理后的血液富含氨基酸和短肽，可應(yīng)用于制備氨基酸肥料，最終實(shí)現(xiàn)廢棄血液循環(huán)利用的可持續(xù)發(fā)展道路。

1996年，解硫胺素芽孢桿菌被正式命名，目前共3個種[3]。米氏硫胺素芽孢桿菌屬于芽孢桿菌科解硫胺素芽孢桿菌屬，桿狀，為革蘭氏陽性菌，芽孢呈橢圓形，芽孢亞端生、近中生、中生、包囊稍膨大，能夠在營養(yǎng)瓊脂和酪朊大豆瓊脂等培養(yǎng)基中生長[4]。目前國內(nèi)外對米氏硫胺素芽孢桿菌的研究主要集中于分離鑒定[5-6]、生物降解[7-8]、生物防治[9-10]及基因序列[11-12]等方面。本文初次研究米氏硫胺素芽孢桿菌降解牦牛血液的能力，為探究微生物法降解血液提供了一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集采集于甘肅省蘭州市一屠宰場深度20～30 m處的土樣，地理坐標(biāo)為N 36°03′，E 103°40′。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

水解酪蛋白胨（MH）肉湯干粉培養(yǎng)基、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉（天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；黃豆餅粉（北京鴻潤寶順科技有限公司）；氯化鈉、無水碳酸鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；水解酪蛋白胨（MH）瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、革蘭氏染色試劑（博精索拉博科技有限公司）、福林酚試劑（北京索萊寶科技有限公司）、細(xì)菌DNA提取試劑盒（TaKaRa-美谷生物科技有限公司）；胰化蛋白胨、酵母提取粉（OXOID公司）；三氯乙酸（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、血瓊脂平板（鄭州安圖生物工程股份有限公司）、細(xì)菌生化鑒定管（杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)）。

1.1.3 培養(yǎng)基

水解酪蛋白胨（MH）瓊脂培養(yǎng)基：可溶性淀粉1.5 g/L、瓊脂17 g/L、牛肉浸粉2 g/L、酸水解酪蛋白17.5 g/L。

LB液體培養(yǎng)基：氯化鈉10 g/L、酵母提取物5 g/L、胰化蛋白胨10 g/L。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉4 g/L、黃豆餅粉3 g/L、磷酸氫二鈉4 g/L、磷酸二氫鉀0.3 g/L。

LB固體培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g/L、酵母提取粉5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂粉20 g/L。

1.1.4 試驗(yàn)儀器

13395H2XBME顯微鏡（上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）、電泳儀（北京六一儀器設(shè)備公司）、AR224CN電子天平（奧豪斯儀器常州有限公司）、YXQ-LS全自動立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、微波爐（廣東格蘭仕公司）、SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、恒溫恒濕箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集采用無菌袋從屠宰場廢棄血液存放地采集土壤樣品，實(shí)驗(yàn)室低溫保存柜中凍存；血液樣品亦采集自屠宰場。

1.2.2 菌株的純化篩選

將土壤樣品進(jìn)行10-3～10-5梯度稀釋，取200 μL稀釋液涂布于血瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。挑取溶血環(huán)較大的單菌落劃線接種于血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24 h直至純化成功，將有溶血環(huán)的菌株按常規(guī)方法保存。

1.2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

分離株劃線接種于血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落顏色、大小、形狀、邊緣、隆起、透明度等指標(biāo)。挑取少量菌落革蘭氏染色后鏡檢，在光學(xué)顯微鏡油鏡下觀察菌體細(xì)胞的形狀、大小及染色結(jié)果[1]。

1.2.4 生化鑒定

挑取純化單菌落于LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。吸取50 μL菌液于硝酸鹽還原、氨基酸水解、枸櫞酸鹽等，按生化鑒定管說明書中條件培養(yǎng)，觀察并記錄試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 藥敏試驗(yàn)

挑取純化單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。吸取150 μL量菌液于水解酪蛋白胨（MH）瓊脂培養(yǎng)基中涂布均勻。在LB固體培養(yǎng)基上等間距放置阿米卡星、慶大霉素、鏈霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星等藥片，37℃培養(yǎng)24 h，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6 16S rRNA基因序列鑒定

挑取目標(biāo)菌株至LB液體培養(yǎng)基，在37℃180 r/min搖床培養(yǎng)10 h。取1.5 mL培養(yǎng)液，使用細(xì)菌DNA提取試劑盒，提取菌株NWMCC0050基因組DNA。采用16S rRNA全長引物合成27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，擴(kuò)增細(xì)菌核糖體16S rRNA。將PCR產(chǎn)物送至北京擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rRNA基因序列的測序。所得序列上傳至數(shù)據(jù)庫GenBank，利用BLASTN功能對測序所得16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性的比對，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建相應(yīng)的系統(tǒng)進(jìn)化樹[13]。

1.2.7 蛋白酶活力測定

取1環(huán)細(xì)菌接入LB液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h，以3%接種量接入80 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，置于250 mL搖瓶，37℃搖床180 r/min發(fā)酵30 h，取上清液，采用福林法檢測其中蛋白酶的酶活力[14]。

1.2.8 血液降解效果測定

挑取目標(biāo)菌株至LB液體培養(yǎng)基，37℃180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。另取30 mL牦牛血8 000 r/min離心1 min，加入純水制備成100 mL血液培養(yǎng)基。培養(yǎng)物按2%接種量接入血液培養(yǎng)基，在37℃條件下培養(yǎng)85 h，測定總氮和游離氮。游離氮的測定依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》GB 5009.5—2016中甲醛法，總氮的測定依照其中凱氏定氮法，并計(jì)算降解效率[2]。

發(fā)酵液降解度（DH）=A/N×100% （1）

式中：A為發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量；N為底物中所含總氮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定（見圖1、圖2）

由圖1可知，純化后的菌株為需氧菌，于血瓊脂平板培養(yǎng)基上可形成乳白色、不透明、無金屬光澤、突起、邊緣不整齊的大菌落，在血瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)后可見典型的β型溶血。

圖1 菌株NWMCC0050血瓊脂平板培養(yǎng)結(jié)果Fig.1 Result of blood agar plate culture of strain NWMCC0050

由圖2可知，分離株為革蘭陽性桿菌，產(chǎn)芽孢，單個、成對或成列排布。根據(jù)對分離培養(yǎng)菌形態(tài)學(xué)特性初步分析，分離株初步判定為芽孢桿菌，并命名為NWMCC0050。

圖2 菌株NWMCC0050革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Gram staining result of strain NWMCC0050

2.2 菌株NWMCC0050生化鑒定結(jié)果（見表1）

由表1可知，在生化試驗(yàn)中菌株NWMCC0050可利用麥芽糖、葡萄糖及還原硝酸鹽，反應(yīng)結(jié)果為陽性。該菌無法利用乳糖、阿拉伯糖、山梨糖、衛(wèi)矛醇、甘露醇、水楊素、硫化氫、尿素及肌醇等物質(zhì)，反應(yīng)結(jié)果為陰性。

表1 菌株NWMCC0050生化鑒定結(jié)果Tab.1 Biochemical identification results of strain NWMCC0050

2.3 菌株NWMCC0050藥敏試驗(yàn)結(jié)果（見表2）

由表2可知，菌株NWMCC0050對14種抗生素的敏感性各不相同：對阿莫西林（AMC30）、頭孢噻吩（KF30）、頭孢他啶（CAZ30）表現(xiàn)耐藥，對紅霉素（E15）、氯霉素（C30）、頭孢西?。‵OX30）表現(xiàn)中介，對阿米卡星（AK30）、慶大霉素（CN10）、鏈霉素（S10）、四環(huán)素（TE30）、多西環(huán)素（DO30）、環(huán)丙沙星（CIP5）、克林霉素（DA2）、萬古霉素（VA30）等8種藥物表現(xiàn)為敏感。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株NWMCC0050符合解硫胺素芽孢桿菌的特點(diǎn)。

表2 菌株NWMCC0050藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Result of drug sensitivity test of strain NWMCC0050

2.4 菌株NWMCC0050的16S rRNA基因序列鑒定（見圖3、圖4）

由圖3可知，菌株NWMCC0050的DNA提取基因序列條帶大約為15 000以上。

圖3 提取細(xì)菌組DNA瓊脂糖電泳凝膠結(jié)果Fig.3 Result of agarose gel electrophoresis of DNA extracted from bacteria

使用NCBI中BLAST功能將GenBank數(shù)據(jù)庫中16S rRNA基因序列與菌株NWMCC0050的16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示，菌株NWMCC0050與Aneurinibacillus migulanusstrain NBRC 15520的序列相似性為99.85%。在BLAST下載與菌株NWMCC0050基因序列最相似的10組菌株的16S rRNA基因序列，通過軟件MEGA 7.0進(jìn)行多重比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。

由圖4可知，菌株NWMCC0050與解硫胺素芽孢桿菌位于同一個分支，遺傳距離較近，鑒定為芽孢桿菌屬的解硫胺素芽孢桿菌。

圖4 菌株NWMCC0050基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of NWMCC0050 gene sequence of isolates

2.5 菌株NWMCC0050蛋白酶活力的測定（見圖5）

以吸光度值為橫坐標(biāo)，酪氨酸濃度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

由圖5可知，該菌株產(chǎn)蛋白酶活力標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.010 1x+0.000 4，R2=0.999 4。當(dāng)光密度為1時(shí)，計(jì)算得酪氨酸質(zhì)量K=98.61，蛋白酶活力為139.54 U/mL。

圖5 酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of enzyme activity

2.6 血液蛋白降解效果（見圖6）

測得試驗(yàn)組中氨基態(tài)氮含量為281.73 g/100 L，血液中總氮含量為2 856.26 g/100 L。通過公式計(jì)算得出菌株NWMCC0050對血液的降解率為9.86%。

由圖6可知，未降解前的血液呈紅色，降解后的血液顏色加深，表明菌株NWMCC0050對血液具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，能夠一定程度上降解血液，可作為降解廢棄血液的備用菌株。

圖6 血液培養(yǎng)基降解前后變化Fig.6 Changes before and after degradation of blood medium

3 討論

利用微生物法降解屠宰場廢棄血液進(jìn)而制備氨基酸有機(jī)肥的關(guān)鍵是篩選產(chǎn)蛋白酶酶活力高、血液降解能力強(qiáng)的菌株。李浩麗等[15]在菜市場新鮮豬血中分離得到1株芽孢桿菌，測定其酶活為150.86 U/mL。Yao等[16]從屠宰場取樣分離出1株短小芽孢桿菌，其蛋白酶活力可達(dá)35.437 U/mL，當(dāng)血粉添加量為2.1%時(shí)，可降解85%的血紅蛋白。陶艷華等[17]從南京某屠宰場分離到1株短小芽孢桿菌，在培養(yǎng)基中降解率達(dá)53.64%。

本研究分離得到的解硫胺素芽孢桿菌的蛋白酶活力低于上述幾種菌株，推測可能是發(fā)酵培養(yǎng)基選擇不當(dāng)、發(fā)酵條件有待優(yōu)化或位于胞內(nèi)的蛋白酶未能穿過胞外所致。菌株NWMCC0050血液降解效率的提升可通過探究其在血液培養(yǎng)基中的不同生長條件進(jìn)行逐步優(yōu)化，之后多種菌株混合培養(yǎng)以及菌酶混合培養(yǎng)也是提升菌株血液降解效率的優(yōu)良方法。此外，本研究為分離鑒定可降解血液的菌株以及初步探究其血液降解能力提供了一種簡單且可供參考的試驗(yàn)方法。

氨基酸肥料是一種新型的生態(tài)肥料，其使用范圍也將愈發(fā)廣泛[18]。溫明霞等[19]研究表明，噴施氨基酸肥料可增加春梢的果皮亮度及可食率。趙勇[20]研究表明，施用氨基酸肥料的黨參可增產(chǎn)2 075 kg/hm2。李廷勛等[21]利用地衣芽孢桿菌和大豆來源的蛋白酶降解家畜血液，制成了1種液態(tài)氨基酸肥料，均衡地保留了充足的二重縮氨酸、三重縮氨酸等各種形態(tài)的氨基酸，使肥效更加持久；同時(shí)采用地衣芽孢桿菌對血液進(jìn)行前處理，有效減少酶的用量及制備時(shí)間，節(jié)約了制備的成本，為后續(xù)研究提供了一種可行思路。目前，國內(nèi)外對微生物法降解廢棄血液的研究尚不夠深入，利用此法制備氨基酸液態(tài)肥亟須進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究利用血瓊脂平板從甘肅一屠宰場血液浸潤土樣中分離得到菌株NWMCC0302，根據(jù)形態(tài)學(xué)、生化鑒定及16S rDNA測序分析，鑒定為短小芽孢桿菌。當(dāng)目標(biāo)菌株以2%的接種量添加到體積分?jǐn)?shù)為30%的牦牛血液培養(yǎng)基中時(shí)，經(jīng)37℃180 r/min搖床培養(yǎng)85 h可測得其對血液培養(yǎng)基的降解效率達(dá)9.86%，具有一定的降解血液能力。