張 絨，陳仲婷，劉賢釗，李慧芳

（無限極（中國）有限公司，廣東江門 529100）

許多中草藥能夠抑制微生物的生長，在不同配比的中草藥產(chǎn)品中，抑菌成分和作用程度各不相同，有抑菌成分時可能會導(dǎo)致供試品中的微生物無法檢出[1]。為消除抑菌成分的影響，需對不同產(chǎn)品建立適宜的微生物限度檢查方法。

本研究針對含有中草藥陳皮、茯苓等成分的保健食品樣品通過人為加入標(biāo)準(zhǔn)菌株，參考《中華人民共和國藥典》（2020年版）四部通則（1105）非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查[2]，對該樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，以建立適宜的微生物限度檢查方法，保證檢驗(yàn)方法的科學(xué)及準(zhǔn)確性，從而保證產(chǎn)品質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)樣品含中草藥成分陳皮、茯苓片劑（21J05AAB01、21J05ABB01、21J05ACB01）。

1.1.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基及試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司、北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；孟加拉紅瓊脂（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司、北京陸橋技術(shù)股份有限公司）；無菌生理鹽水（氯化鈉，AR，廣州化學(xué)試劑廠）；中和劑1：含3%吐溫+1%卵磷脂+1%硫代硫酸鈉的PBS溶液；中和劑2：D/E中和肉湯（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；中和劑3：含3%吐溫+1%甘氨酸+1%硫代硫酸鈉的PBS溶液。

1.1.3 試驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌ATCC 653、銅綠假單胞菌ATCC 27853、枯草芽孢桿菌ATCC 6633、白色念珠菌ATCC 10231和黑曲霉ATCC 16404，均來源于廣東省微生物菌種保藏中心（國家專利菌種保藏平臺）。

1.1.4 試驗(yàn)設(shè)備及耗材

（1）設(shè)備：超凈工作臺（VS-1300-U）、生物安全柜（BSC-1300-II-B1）、生化培養(yǎng)箱（BF400）、霉菌培養(yǎng)箱（MJ-Ⅱ）、恒溫水浴箱（DK-S14）、均質(zhì)器（Pulisifier）、振蕩器（MS 3-basic）、移液器及無菌吸頭（Eppendorf）。

（2）耗材：無菌三角瓶、無菌培養(yǎng)皿和無菌試管均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 方法適用性試驗(yàn)

按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）[3]和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 霉菌和酵母計(jì)數(shù)》（GB 4789.15—2016）[4]進(jìn)行試驗(yàn)。

（1）樣品制備。25 g樣品加入225 mL稀釋液（或含中和劑稀釋液）中充分溶解，混合均勻。

（2）試驗(yàn)組。將試驗(yàn)菌株金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉制成一定濃度的菌懸液加入供試品中，使每 mL樣液中含菌量30～300 CFU。為確認(rèn)供試品中的微生物能被充分檢出，首先應(yīng)選擇最低稀釋級的供試液進(jìn)行計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)。加菌液的體積應(yīng)不超過供試液體積的1%。

作者要寫的關(guān)鍵詞是“幸?！?但用了形象化的筆觸,比如“心里卻急烈地跳動”“擠進(jìn)他底心”“暈倒”“癡呆”等。并且用他想的曾經(jīng)“孤零”“單獨(dú)”“孤獨(dú)”的他來反襯,進(jìn)一步凸顯此刻的幸福。

（3）樣品對照組。取制備好的樣液，以稀釋液代替菌液同試驗(yàn)組操作。

（4）菌液對照組。取不含中和劑及滅活劑的相應(yīng)稀釋液替代樣液，按試驗(yàn)組操作加入試驗(yàn)菌液。

1.2.2 專屬性試驗(yàn)

在供試品中接種一定數(shù)量的混合試驗(yàn)菌，制成高、中、低3組濃度，按照GB 4789.2—2016、GB 4789.15—2016方法檢驗(yàn)。

1.2.3 重復(fù)性試驗(yàn)

在供試品中接種一定數(shù)量的混合試驗(yàn)菌，分別由2名不同實(shí)驗(yàn)員在不同時間、不同條件下，按照GB 4789.2—2016、GB 4789.15—2016方法分別進(jìn)行菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢驗(yàn)。

1.2.4 精密度試驗(yàn)

1.2.5 耐用性試驗(yàn)

在供試品中接種一定數(shù)量的混合試驗(yàn)菌，按照GB 4789.2—2016、GB 4789.15—2016方法分別進(jìn)行菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的檢驗(yàn)，比較2種不同供應(yīng)商的培養(yǎng)基培養(yǎng)后的試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果分析

2.1 方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

通過表1可知，供試品中含有一定的抑菌活性，當(dāng)使用中和劑1（3%吐溫+1%卵磷脂+1%硫代硫酸鈉）時，可以有效消除抑菌活性，使金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉有較好的回收PR值（PR值在0.5～2.0），而對枯草芽孢桿菌使用中和劑2（D/E肉湯）、調(diào)節(jié)pH 6.5～7.5、膜過濾以及使用中和劑3（3%吐溫+1%卵磷脂+1%硫代硫酸鈉），試驗(yàn)結(jié)果的回收PR值均＜0.5，之后的試驗(yàn)項(xiàng)目取消對枯草芽孢桿菌的驗(yàn)證。

表1 計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 專屬性試驗(yàn)結(jié)果

通過表2、表3可知，當(dāng)樣品加入低、中、高3個濃度的目標(biāo)菌株時，菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的實(shí)驗(yàn)回收率均≥70%，符合專屬性要求。

表2 菌落總數(shù)專屬性試驗(yàn)結(jié)果

表3霉菌和酵母菌總數(shù)專屬性試驗(yàn)結(jié)果

2.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

通過表4、表5可知，參照《中國藥典》（2020版）四部（9201），以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差評價方法重復(fù)性，不同人員菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的試驗(yàn)結(jié)果的RSD值均小于15%，符合重復(fù)性要求。

表4 菌落總數(shù)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表5 霉菌和酵母菌總數(shù)重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

通過表6、表7可知，參照《中國藥典》（2020版）四部（9201），以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差評價方法的精密度，菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)通過高、中、低3個試驗(yàn)菌濃度，每個濃度進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)的計(jì)數(shù)結(jié)果的RSD值均小于35%，回收率均大于70%，符合精密度要求。

表6 菌落總數(shù)精密度試驗(yàn)結(jié)果

表7 霉菌和酵母菌總數(shù)精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 耐用性試驗(yàn)結(jié)果

通過表8、表9可知，兩個供應(yīng)商的培養(yǎng)基的菌落總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的試驗(yàn)結(jié)果對數(shù)絕對值差均≤0.25，符合耐用性要求。

表8 不同供應(yīng)商菌落總數(shù)培養(yǎng)基的對比結(jié)果

表9 不同供應(yīng)商霉菌和酵母菌總數(shù)培養(yǎng)基的比對結(jié)果

3 結(jié)論

（1）該保健食品樣品按照GB 4789.2—2016、GB 4789.15—2016進(jìn)行菌落總數(shù)、霉菌和酵母計(jì)數(shù)測定，方法適用性驗(yàn)證結(jié)果均符合方法學(xué)要求。該樣品有一定的抑菌活性，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，使用3%吐溫+1%卵磷脂+1%硫代硫酸鈉作為中和劑，可以有效消除抑菌活性，回收率、重復(fù)性、專屬性、精密度和耐用性等均符合要求。

（2）驗(yàn)證使用的枯草芽孢桿菌經(jīng)過添加3%吐溫+1%卵磷脂+1%硫代硫酸鈉作為中和劑、D/E肉湯中和劑、調(diào)節(jié)pH值為 6.5～7.5、膜過濾等方式其驗(yàn)證效果均不理想，表明該供試品對枯草芽孢桿菌有較強(qiáng)的抗菌活性，同時也表明該中草藥保健食品不易被枯草芽孢桿菌污染，所以建議取消對枯草芽孢桿菌的驗(yàn)證試驗(yàn)。

（3）中草藥成分復(fù)雜，抑菌成分各有不同，任何成分都有可能影響微生物限度檢查結(jié)果，本研究為微生物限度檢查方法適用性試驗(yàn)的研究提供參考和研究思路，進(jìn)一步保證方法完整和準(zhǔn)確[5]。