陳智玲，馬 劍，文 博，黃午陽，馬艷弘,

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014；

2.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

藍莓（spp.）又稱越橘、藍漿果，呈藍色，口感酸甜，具有較高的食用及保健價值，是聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）推薦的五大健康食品之一。藍莓渣作為藍莓產(chǎn)品加工的主要副產(chǎn)物，通常作為廢物被處理掉，造成資源的極度浪費。有研究報道，藍莓渣中含有維生素、花色苷、氨基酸、黃酮、多酚、膳食纖維等營養(yǎng)成分。其中藍莓花色苷作為天然的抗氧化劑，具有抗炎、抗癌、護肝、抗衰老、保護心血管、降血糖等多種生理功能。因此，藍莓渣具有較高的開發(fā)與利用價值。

隨著科技的發(fā)展，目前，花色苷的提取技術(shù)主要有熱回流法、有機溶劑浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和酶解法等?；ㄉ招再|(zhì)極不穩(wěn)定，其結(jié)構(gòu)易受到提取過程中溫度和pH等因素的影響，導致降解而失去其生物活性，因此，在追求操作簡便的提取過程的同時，還要防止花色苷生物活性失活。超高壓提取技術(shù)為新興非熱加工技術(shù)，超高壓提取法是通過升高壓力對原料細胞形成較大的作用力，造成細胞壁的破裂，加速基質(zhì)內(nèi)活性成分與溶劑的接觸，從而活性成分更易溶于提取溶劑中。超高壓提取技術(shù)具有短時、節(jié)能、操作簡單、高效等優(yōu)點，能夠很好地保持熱敏性及小分子物質(zhì)的活性。目前不僅用于果醬、果酒等的滅菌處理及中藥材營養(yǎng)成分等物質(zhì)的提取，還可用于植物中活性物質(zhì)的提取，比如花青素/花色苷等。Corrales等采用超高壓技術(shù)提取葡萄皮中的花青素，并發(fā)現(xiàn)在50%乙醇濃度、70 ℃和600 MPa條件下獲得的葡萄皮花青素具有最高的抗氧化能力，且得率是對照組的三倍。陳亞利等采用超高壓輔助提取紫薯花色苷，在檸檬酸溶液濃度為2.0%、料液比1:40 g/mL、保壓時間3 min、提取壓力200 MPa時，花色苷得率為82.85 mg/100 g。杜月嬌采用超高壓技術(shù)提取“雙紅”山葡萄花青素，在料液比為8.5:1、壓力200 MPa、保壓時間2 min下，花青素含量最高為0.304±0.007 g/100 g。目前，采用超高壓技術(shù)對藍莓渣花色苷進行提取尚未見報道。

本文通過響應面分析法，確定藍莓渣花色苷的最佳提取工藝參數(shù)，采用高效液相色譜（HPLC）法對花色苷提取物的組分進行分析鑒定，并通過分析藍莓渣花色苷的抗氧化活性，從而為藍莓渣的高值開發(fā)利用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

兔眼藍莓渣 藍莓飲料生產(chǎn)副產(chǎn)物，句容萬山紅遍生物科技有限公司；氯化鉀 分析純，西隴科學股份有限公司；無水乙醇、苯酚、濃硫酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵、水楊酸 均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；DPPH、維生素C、2，4，6-三吡啶基三嗪上海源葉生物科技有限公司；過氧化氫 分析純，天津市大茂化學試劑廠；乙酸鈉 分析純，上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、甲醇 分析純，美國ROE公司。

D-8紫外可見分光光度計 上海奧析科學儀器有限公司；HPP 600 MPa超高壓食品處理裝置 包頭科發(fā)高壓科技有限責任公司；KQ-400 DE超聲波設備 昆山市超聲儀器有限公司；FE-20 pH酸度計梅特勒-托利多儀器有限公司；TGL-16B臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；D-RE-600A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮生化儀器廠；FDU-1200 冷凍干燥機 日本EYELA公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀美國安捷倫公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 2020年7月30日，在句容萬山紅遍生物科技有限公司獲得兔眼藍莓果渣。將藍莓渣置于40 ℃烘箱中烘干至恒重，然后用細胞破壁機將烘干的果渣粉碎，過60目篩，于20 ℃冰箱中進行低溫避光密封保藏備用。

1.2.2 超高壓輔助法提取莓渣花色苷 參照陳亞利等的研究方法并稍作修改，準確稱取藍莓渣50 g置于聚乙烯袋中，按照一定的料液比加入適當體積的鹽酸酸化的乙醇溶液（pH3.0），封口后置于超高壓設備中，于一定壓力下保壓處理一段時間。然后于4500 r/min下離心15 min，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對上清液加以濃縮，將濃縮樣品用pH3.0蒸餾水重新定容至500 mL待用。

1.2.3 超高壓輔助提取法單因素實驗 在預實驗的基礎上，固定藍莓渣重量為3.0 g，乙醇溶液的pH3.0，分別探究乙醇濃度、提取壓力、提取時間、料液比和溫度這五個因素對藍莓渣花色苷提取量的影響。

1.2.3.1 不同乙醇濃度對花色苷提取量的影響 稱取3.0 g藍莓渣于聚乙烯袋中，以料液比1:25 g/mL加入不同濃度（40%、50%、60%、70%、80%）的乙醇溶液，在提取壓力為400 MPa、溫度為25 ℃下提取6 min，考察不同乙醇濃度對花色苷提取量的影響。

1.2.3.2 不同提取壓力對花色苷提取量的影響 稱取3.0 g藍莓渣于聚乙烯袋中，料液比為1:25 g/mL，乙醇濃度為60%，溫度為25 ℃，在不同提取壓力（100、200、300、400、500 MPa）下提取 6 min，考察不同提取壓力對花色苷提取量的影響。

1.2.3.3 不同提取時間對花色苷提取量的影響 稱取3.0 g藍莓渣于聚乙烯袋中，以料液比為1:25 g/mL加入濃度為60%的乙醇溶液，在提取壓力為400 MPa、溫度為 25 ℃ 下，考察不同提取時間（3、6、9、12、15 min）對花色苷提取量的影響。

1.2.3.4 不同料液比對花色苷提取量的影響 稱取3.0 g藍莓渣于聚乙烯袋中，按照不同料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）加入乙醇溶液（濃度為60%），設置提取壓力為400 MPa、提取時間為9 min、溫度為25 ℃，考察不同料液比對花色苷提取量的影響。

1.2.3.5 不同溫度對花色苷提取量的影響 稱取3.0 g藍莓渣于聚乙烯袋中，按照料液比120 g/mL加入乙醇溶液（濃度為60%），設置提取壓力為400 MPa、提取時間為 9 min，考察不同溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）對花色苷提取量的影響。

1.2.4 超高壓輔助法提取響應面試驗 采用RSM分析法，選取乙醇濃度（A）、提取壓力（B）、提取時間（C）及料液比（D）四個試驗因素，每個因素設三個水平，以（Y）花色苷提取量為響應面值，進行響應面分析，試驗因素和水平設計見表1。

表1 因素及水平編碼表Table 1 Factors and levels table

1.2.5 花色苷最大吸收波長的測定 研究表明，花色苷在500～530 nm波長范圍內(nèi)有特征吸收峰。將藍莓渣花色苷提取液稀釋后，采用酶標儀在400～700 nm波長范圍內(nèi)對提取液進行掃描，采用Origin 2019軟件作光譜曲線圖，得到藍莓渣花色苷的最大吸收波長。

1.2.6 花色苷提取量的測定 采用pH示差法測定花色苷提取量，參照Chiou等方法略有改動。取藍莓渣花色苷提取液1 mL，分別加入pH1.0和pH4.5緩沖液9 mL，平衡20 min后于520 nm和700 nm處測吸光度值，花色苷提取量的計算公式如下。

式中：M—相對分子質(zhì)量，442.9；Df—稀釋倍數(shù)；V—提取液體積（L）；—摩爾消光系數(shù)，26900；L—光程，1 cm；m—樣品質(zhì)量（g）。

1.2.7 不同提取方法得到的花色苷提取量的比較

1.2.7.1 傳統(tǒng)溶劑浸提法提取藍莓渣花色苷 參照金麗梅等方法略作修改，準確稱取藍莓渣50 g置于聚乙烯袋中，以料液比1:20 g/mL加入鹽酸酸化的乙醇溶液（pH3.0，60%乙醇），封口后于60 ℃水浴鍋中保溫60 min。然后于4500 r/min下離心15 min，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀對上清液加以濃縮，將濃縮樣品用pH3.0蒸餾水重新定容至500 mL待用。

1.2.7.2 超聲輔助法提取藍莓渣花色苷 參照Tan等方法略作修改，準確稱取藍莓渣50 g置于聚乙烯袋中，以料液比1:20 g/mL加入鹽酸酸化乙醇溶液（pH3.0，60%乙醇），封口后于超聲設備中處理，超聲功率300 W，超聲時間60 min，溫度為25 ℃。然后于4500 r/min下離心15 min，收集上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加以濃縮，將濃縮樣品用pH3.0蒸餾水重新定容至500 mL待用。

測定以上兩種提取方法得到的花色苷提取量，與超高壓輔助提取法在最優(yōu)工藝條件下的花色苷提取量進行比較。

1.2.8 藍莓渣花色苷組分分析

1.2.8.1 樣品制備 按照1.2.4中優(yōu)化得到的超高壓最佳提取工藝，制備藍莓渣花色苷提取液，采用AB-8大孔樹脂進行吸附解吸后，收集解吸液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，將濃縮液置于冷凍干燥機中凍干，得到干燥的藍莓渣花色苷樣品。進行液相色譜分析之前，稱取樣品5 mg，使用超純水溶解樣品，樣品濃度為2.5 mg/mL，并用0.22 μm的微孔過濾膜過濾，備用。

1.2.8.2 高效液相色譜（HPLC）分析 參照Hutabarat等方法，采用Agilent 1200高效液相色譜儀對藍莓渣花色苷組分進行色譜分析。色譜條件：反相色譜柱Eclipse XDB-C色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相包括A（含1%磷酸的超純水）和B（100%乙腈）。梯度洗脫如下：5% 流動相 B（0～5 min），5%～10% 流動相 B（5～15 min），10% 流動相 B（15～25 min），10%～12% 流動相 B（25～35 min），12%～15% 流動相B（35～50 min），15%～18% 流動相 B（50～60 min），18%～25% 流動相 B（60～80 min），25%～30% 流動相B（80～90 min）。流速為0.6 mL/min；檢測波長520 nm；進樣量為10 μL；柱溫25 ℃。使用矢車菊素-3-葡萄糖苷作為標準品，用雙蒸水將其配制成不同的濃度（5、10、100、1000 μg/mL），以標準品質(zhì)量濃度 x 為橫坐標，峰面積y為縱坐標，繪制標準曲線，根據(jù)標準曲線計算每種花色苷單體的當量濃度，結(jié)果以矢車菊素-3-葡萄糖苷（μg）/藍莓渣凍干粉（g）表示。由于所用高效液相色譜儀相同，色譜條件相同，根據(jù)文獻[18]對比出峰時間與順序?qū)λ{莓渣花色苷組分進行鑒定。

1.2.9 藍莓渣花色苷抗氧化活性測定 按1.2.8.1制得凍干的藍莓渣花色苷樣品，在使用前用蒸餾水將藍莓渣花色苷樣品復溶并稀釋成所需的質(zhì)量濃度，通過DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力和FRAP鐵離子還原能力的測定，評價藍莓渣花色苷的抗氧化活性。

1.2.9.1 DPPH?清除能力的測定 參照Jiang等方法，分別取濃度為 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mg/mL的藍莓花色苷溶液2 mL，然后分別向試管中加入2 mL DPPH乙醇溶液，用渦旋儀混勻后避光靜置30 min，測定波長為517 nm。

式中： A表示樣品加DPPH乙醇溶液的吸光度；A表示樣品加乙醇溶液的吸光度； A表示乙醇溶液加DPPH乙醇溶液的吸光度。

1.2.9.2 ?OH清除能力測定 參考Tai等研究方法并略有修改，取1 mL（9 mmol/L）硫酸亞鐵溶液，按順序加入1 mL水楊酸-乙醇溶液（1.5 mg/mL），1 mL不同濃度的花色苷樣品溶液（0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mg/mL），1 mL的過氧化氫（1%），37 ℃ 水浴1 h，于510 nm波長處進行檢測， ·O H清除率計算如下：

式中： A表示樣品組的吸光度； A表示無水乙醇取代水楊酸-乙醇溶液的吸光度； A表示蒸餾水代替樣品溶液的吸光度。

1.2.9.3 Fe還原能力的測定 參照Jing等方法，分別配制醋酸鈉緩沖液、FeCl溶液和TPTZ溶液，按照10:1:1的體積比制備得到FRAP儲備溶液。FeSO標準曲線的制作：將配好的FeSO溶液稀釋為 100、200、400、800、1600 μmol/L 幾個不同濃度，取0.3 mL FeSO溶液，加入2.7 mL FRAP儲備溶液，將混合液置于37 ℃水浴10 min后，于593 nm處進行讀數(shù)?；ㄉ諛悠啡芤旱腇e還原能力檢測步驟同標準曲線測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

重復試驗3次，采用Excel 2010、Design-Expert 8.0.6.1、Origin 2019軟件等進行數(shù)據(jù)分析與作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍莓渣花色苷最大光吸收波長的確定

如圖1所示，UPE、USE、CSE三種提取方法得到的花色苷提取液均在520 nm波長處具有吸收峰，此為花色苷的特征吸收峰。因此，藍莓渣花色苷的最大吸收波長為520 nm。

圖1 藍莓渣花色苷提取液光譜掃描曲線圖Fig.1 Spectral scanning curve of blueberry pomace anthocyanin extracts

2.2 單因素實驗結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇濃度對花色苷提取量的影響 由圖2可見，隨著乙醇在提取溶劑中比例不斷增大，花色苷提取量先增大后減小。當乙醇濃度為60%的時候，提取效果最好，提取量為5.87±0.04 mg/g；當繼續(xù)增大乙醇濃度，花色苷提取量出現(xiàn)顯著下降的趨勢（＜0.05）。與王鑫等采用超高壓提取藍莓花青素的研究結(jié)果相似。其原因是60%乙醇與花色苷極性相似，在這種相似相溶的情況下，花色苷提取量最大；乙醇濃度繼續(xù)增大，溶液極性降低，花色苷的溶解度降低，甚至還會出現(xiàn)花色苷降解的情況，可能產(chǎn)生許多醇溶性的雜質(zhì)。因此，選擇范圍在50%～70%的乙醇濃度進行優(yōu)化。

圖2 不同乙醇濃度對花色苷提取量的影響Fig.2 Effect of different ethanol concentration on extraction amout of anthocyanins

2.2.2 提取壓力對花色苷提取量的影響 如圖3所示，隨著壓力的升高，花色苷提取量增大，當提取壓力增大到 400 MPa時，提取量最高（5.89±0.05 mg/g）；繼續(xù)增加提取壓力，花色苷提取量略微下降。與姜秀杰等提取黑豆花青素的結(jié)果具有相似趨勢。分析其原因，藍莓渣原本完整的細胞膜上的結(jié)構(gòu)蛋白在高壓壓迫下會遭到破損，細胞膜的通透性增大，提取溶劑更容易進入到細胞中，而花色苷也更容易溶解到細胞外，導致花色苷提取量提高。但壓力過大時，提取量反而下降，因其高壓可能破壞花色苷的結(jié)構(gòu)，進而影響花色苷的溶出，而且，超高壓設備的壓力設置過高會承受更大的負擔。因此，最適提取壓力在300～500 MPa范圍內(nèi)。

圖3 不同提取壓力對花色苷提取量的影響Fig.3 Effect of different extraction pressure on extraction amout of anthocyanins

2.2.3 提取時間對花色苷提取量的影響 如圖4所示，提取時間在3～9 min時，隨著時間增加，花色苷提取量增大，在提取時間為9 min時，提取量最大（5.86±0.05 mg/g）；當提取時間超過 9 min 后，花色苷的提取效果減弱。該結(jié)果和張唯等采用超高壓提取玫瑰花色苷的特點相符合。原因是初始提取時藍莓渣細胞內(nèi)外的濃度梯度較大，具有較大驅(qū)動力，有利于花色苷溶出，使得花色苷提取效果得到加強。但繼續(xù)增加提取時間，會導致花色苷的降解，從而導致花色苷提取量降低。因此，選取6～12 min的提取時間。

圖4 不同提取時間對花色苷提取量的影響Fig.4 Effect of different extraction time on extraction amout of anthocyanins

2.2.4 料液比對花色苷提取量的影響 由圖5可知，當料液比從1:10 g/mL增加到1:30 g/mL時，花色苷提取量在逐漸增加，當料液比為1:30 g/mL時，其提取效果最佳（5.90±0.04 mg/g）。與 Chen 等利用超高壓提取人參皂苷的研究結(jié)果趨勢一致。這是因為溶劑體積的增大使得藍莓渣和提取溶劑之間的界面濃度梯度增大，花色苷受到溶劑的浸潤更容易擴散到溶劑中。然而，過多溶劑的加入會增加其他醇溶性雜質(zhì)的溶解，并破壞花色苷的結(jié)構(gòu)，而且，使用過多的溶劑也會造成資源的浪費且花色苷提取量沒有顯著性差異（＞0.05）。因此，最適料液比在1:15～1:25 g/mL范圍內(nèi)。

圖5 不同料液比對花色苷提取量的影響Fig.5 Effect of different liquid ratio on extraction amout of anthocyanins

2.2.5 溫度對花色苷提取量的影響 如圖6所示，花色苷提取量隨溫度升高而增加，有研究報道這是因為溫度的升高可以增加溶劑的溶解性能，加快分子擴散的速率，從而使花色苷提取量增加。但是溫度范圍在35～60 ℃之間時，花色苷提取量從5.76±0.05 mg/mL增加到5.88±0.06 mg/mL，提取量升高的趨勢不顯著（＞0.05）。這可能是因為在超高壓提取過程中提取時間短，溫度對花色苷的提取效果不明顯。通常隨著壓力的升高，水的溫度也在升高，但是由于高壓容器壁與周圍環(huán)境有熱交換，水的溫度升高不到3 ℃，高壓提取可以維持在接近常溫的條件下進行，同時有利于保持熱敏性物質(zhì)的活性。因此，選擇在常溫下進行后續(xù)試驗。

圖6 不同溫度對花色苷提取量的影響Fig.6 Effect of different temperature on extraction amout of anthocyanins

2.3 響應面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.3.1 模型建立與顯著性分析 在單因素實驗的基礎上，通過Design-Expert 8.0軟件Box-Behnken模式對藍莓渣花色苷提取工藝進行設計，根據(jù)A：乙醇濃度、B：提取壓力、C：提取時間、D：料液比四個因素，Y：花色苷提取量作為響應值，試驗設計方案及結(jié)果見表2所示。

表2 Box-Behnken方案及結(jié)果Table 2 Box-Behnken protocol and results

利用Design-Expert 8.0.6軟件設計試驗方案，得到二次回歸方程：Y=5.93+0.13A+0.12B+0.028C+0.13D-0.034AB+0.088AC-0.20AD+0.20BC-0.070 BD-0.13CD-0.046A-0.68B-0.22C-0.38D

回歸模型分析如表3所示。該回歸模型極顯著（＜0.0001），失擬項不顯著（0.1529＞0.05），決定系數(shù)=0.9798，說明二次回歸方程擬合度高，試驗的精確度高。調(diào)整系數(shù)=0.9597，變異系數(shù)CV=1.65%，說明試驗操作可靠性高，模型可用于分析和預測藍莓渣花色苷的超高壓提取工藝結(jié)果。另外，A、B、D、AD、BC、CD、A、B、C、D對花色苷提取效果影響均極顯著（＜0.01），通過對比值可見對藍莓渣花色苷提取效果的影響程度強弱順序為乙醇濃度（A）＞料液比（D）＞提取壓力（B）＞提取時間（C）。這與李騰對黑果腺肋花楸花色苷的研究結(jié)果一致，即采用超高壓輔助提取黑果腺肋花楸花色苷時，發(fā)現(xiàn)提取壓力和料液比對提取效率的影響程度要大于提取時間。綜上所述，可采用該模型對超高壓輔助提取藍莓渣花色苷進行預測。

表3 回歸模型分析Table 3 Regression model analysis

2.3.2 響應面交互作用分析 等高線圖形呈橢圓形，響應面圖呈拋物線且坡度陡峭說明響應面值受兩變量之間的交互作用影響顯著。由圖7可見，等高線圖為橢圓形，響應面圖的坡度較為陡峭，說明乙醇濃度與料液比、提取壓力與提取時間、提取時間與料液比的交互作用顯著（＜0.05）；而乙醇濃度與提取壓力、乙醇濃度與提取時間、提取壓力與料液比之間的交互作用不顯著（＞0.05）。

圖7 各因素交互作用對花色苷提取量影響的響應面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot of the interaction of various factors on extraction amout of anthocyanins

2.3.3 驗證試驗結(jié)果與分析 通過響應面優(yōu)化試驗得到UPE最佳提取工藝參數(shù)為：乙醇濃度61.21%，提取壓力409.22 MPa，提取時間9.29 min，料液比1:20.55 g/mL，UPE花色苷提取量為5.95 mg/g。調(diào)整參數(shù)為：乙醇濃度60%，提取壓力400 MPa，提取時間9 min，料液比20 g/mL，在這條件下UPE花色苷提取量為5.93±0.06 mg/g，與理論值吻合，由此說明該模型擬合效果良好，適用于藍莓渣花色苷的UPE提取。

2.4 不同提取方法得到的花色苷提取量的比較

如圖8所示，采用超高壓輔助提取法，在最優(yōu)提取工藝條件下所得花色苷提取量為5.93±0.06 mg/g，超聲輔助提取法和傳統(tǒng)溶劑浸提法的花色苷提取量分別為 5.39±0.08 mg/g、4.74±0.11 mg/g。由此可見，UPE對藍莓渣花色苷的提取效果最佳，其花色苷提取量較USE提高了10.02%，較CSE提高了25.11%。這三種提取方法中，超高壓提取法大大縮短了提取時間，且具有最好的提取效果，因此，超高壓輔助提取法適用于藍莓渣花色苷的提取。

圖8 不同提取方法對花色苷提取量的影響Fig.8 Effects of different extraction methods on extraction amout of anthocyanins

2.5 HPLC分析UPE花色苷提取物

由圖9和表4可知，從花色苷超高壓提取物中共檢測到13種不同結(jié)構(gòu)的花色苷，分別為飛燕草色素-3-半乳糖苷、飛燕草色素-3-葡萄糖苷、矢車菊素-3-半乳糖苷、飛燕草色素-3-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷、牽牛花色素-3-半乳糖苷、牽?；ㄉ?3-葡萄糖苷、芍藥素-3-半乳糖苷、牽?；ㄉ?3-阿拉伯糖苷、芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-半乳糖苷、錦葵色素-3-葡萄糖苷、錦葵色素-3-阿拉伯糖苷。將獲得的藍莓花色苷單體的峰面積代入矢車菊素-3-葡萄糖苷標準方程組（y=137.41x+38.185（=0.9977））中，計算每種花色苷的當量，由結(jié)果表4可見，錦葵色素在藍莓渣花色苷中含量最高，峰面積占比為68.44%±0.14%，其中，錦葵色素-3-半乳糖苷含量最高，其矢車菊素-3-葡萄糖苷當量濃度為13953.90±81.08 μg/g。

表4 UPE花色苷提取物的HPLC分析結(jié)果Table 4 HPLC chromatogram analysis results of UPE anthocyanin extract

圖9 UPE花色苷提取物的HPLC圖Fig.9 HPLC chromatogram of UPE anthocyanin extract

2.6 抗氧化活性分析

2.6.1 DPPH自由基清除能力 如圖10所示，濃度為 0.02 mg/mL時，UPE提取物的 DPPH?清除率（82.80%±0.23%）高于 V的 DPPH?清除率（78.67%±0.62%）；濃度在 0.04～0.14 mg/mL范圍內(nèi)，V的DPPH?清除率在各濃度之間差異不顯著（＞0.05），為94.57%～95.24%，而花色苷提取物的DPPH?清除率在90.05%～95.97%之間，呈濃度依賴性關(guān)系。經(jīng)數(shù)據(jù)分析，V和UPE提取物對?DPPH清除能力的IC值（分別為 0.004、0.003 mg/mL）基本接近，可見藍莓渣花色苷對DPPH?清除能力與同濃度的V相比，無顯著性差異（＞0.05）。

圖10 DPPH自由基清除能力的測定Fig.10 Determination of DPPH radical scavenging capacity

2.6.2 羥自由基清除能力 V和UPE提取物的清除羥自由基能力見圖11。在濃度為0.2～0.7 mg/mL范圍內(nèi)，UPE提取物對?OH的清除率顯著上升（＜0.05）；當濃度在 0.7～0.9 mg/mL 之間，UPE 提取物對?OH的清除率趨于穩(wěn)定，各濃度之間差異不顯著（＞0.05）。當質(zhì)量濃度為 0.9 mg/mL時，V和UPE對?OH的清除率分別為：99.96%、98.62%，兩者對羥基自由基的IC分別為0.215、0.262 mg/mL，說明V清除?OH的能力強于UPE花色苷提取物。據(jù)研究報道，陳云霞等采用溶劑萃取法提取的藍莓花色苷，當濃度在0.5%時，花色苷提取物清除?OH的能力強于V，這可能由于花色苷提取方法的不同及花色苷結(jié)構(gòu)差異導致的。

圖11 羥自由基清除能力的測定Fig.11 Determination of hydroxyl radical scavenging ability

2.6.3 FRAP 鐵離子還原能力的測定 如圖12所示，V和花色苷提取物鐵離子還原力均顯示出明顯的劑量依賴效應，還原能力隨著濃度的增大而顯著增大（＜0.05），這與位路路等研究黑果腺肋花楸花色苷的結(jié)論一致。在質(zhì)量濃度200 μg/mL時，V和UPE鐵離子還原能力分別為2251.27、970.17 μmol/L FeSO當量，說明藍莓渣花色苷的鐵離子還原能力比同濃度下V的還原能力弱，這與彭麗莎的研究結(jié)果一致。

圖12 FRAP鐵離子還原能力的測定Fig.12 Determination of FRAP iron reduction ability

3 結(jié)論

以藍莓渣為原料，采用單因素實驗和響應面優(yōu)化的方法，得到超高壓提取花色苷的最佳工藝，并分析其花色苷組分和抗氧化活性。結(jié)果表明，藍莓渣花色苷的的最佳提取條件為：乙醇濃度為60%，提取壓力 400 MPa，提取時間 9 min，料液比1:20 g/mL，此條件下藍莓渣花色苷的提取量為5.93±0.06 mg/g，與超聲輔助提取法和傳統(tǒng)溶劑提取法相比，花色苷提取量分別提高了10.02%、25.11%。藍莓渣花色苷對DPPH自由基和?OH清除率的IC值分別為0.003、0.262 mg/mL，質(zhì)量濃度為 200 μg/mL 時，其 FRAP鐵離子還原能力為970.17 μmol/L FeSO當量。由此可見，藍莓渣花色苷對DPPH?清除能力最強，與同濃度的 V相比，無顯著性差異（＞0.05）；其對?OH的清除率以及FRAP鐵離子還原能力則明顯弱于同濃度V。采用高效液相色譜分析法測得藍莓渣花色苷中含有13種花色苷成分，其中錦葵色素含量最高?？梢?，超高壓輔助提取藍莓渣花色苷具有提取量高、抗氧化能力強等優(yōu)點，可為藍莓渣的綜合利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參數(shù)。