徐相輝，常 強(qiáng)，孫 偉，許姍姍，許博陽，穆冬冬，吳學(xué)鳳，李興江,

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230601；

2.安徽文王釀酒股份有限公司，安徽臨泉 236400）

白酒根據(jù)風(fēng)味特點(diǎn)的不同可分為12種香型，其中濃香型白酒的產(chǎn)量占酒類行業(yè)的70%以上，是中國主要的白酒消費(fèi)品。濃香型白酒采用傳統(tǒng)的固態(tài)發(fā)酵工藝，以高粱、小麥、玉米、糯米和大米為原料，稻殼為疏松劑，以中溫大曲為發(fā)酵劑在泥窖中發(fā)酵60～90 d后蒸餾制得。酒窖底部和側(cè)面均覆蓋有窖泥，獨(dú)特的泥窖發(fā)酵工藝賦予了濃香型白酒窖香濃郁，綿甜爽凈的特點(diǎn)。大量研究表明，窖泥的穩(wěn)定和成熟度與濃香型白酒的品質(zhì)和特征緊密相關(guān)，實(shí)際生產(chǎn)中也發(fā)現(xiàn)“老窖產(chǎn)好酒”。窖泥的成熟是一個(gè)長期馴化的過程，新窖泥到成熟穩(wěn)定狀態(tài)的老窖泥要經(jīng)歷初馴期、過渡期和成熟期三個(gè)階段，需要較長的時(shí)間才能完成成熟轉(zhuǎn)換。

濃香型白酒的發(fā)酵過程涉及大曲、環(huán)境和窖泥多種微生物，也是微生物群落的演替以及各種微生物共生、共酵的過程。通過對(duì)糟醅微生物進(jìn)行溯源分析發(fā)現(xiàn)，糟醅中的原核微生物主要來自窖泥。窖泥被認(rèn)為是原核微生物的持續(xù)釋放源，同時(shí)糟醅中的原核微生物在窖泥成熟和穩(wěn)定中也扮演了重要角色。鄭佳等研究發(fā)現(xiàn)，靠近窖泥的糟醅蒸餾得到的原酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量更加豐富，窖池邊緣的糟醅中己酸、丁酸以及它們對(duì)應(yīng)的己酸乙酯、丁酸乙酯含量也高于同期窖池中間的糟醅。乳酸菌、芽孢桿菌等原核微生物產(chǎn)生己酸、丁酸、乙酸和乳酸等各種有機(jī)酸，作為酯類化合物的底物，參與了糟醅中風(fēng)味化合物的形成。

相比于池壁，池底窖泥所處環(huán)境氧氣更少，并長期浸泡在酸性的黃水中，窖泥微生物所處環(huán)境更為惡劣，因此對(duì)于窖泥理化與微生物的關(guān)聯(lián)分析有助于進(jìn)一步指導(dǎo)新老窖泥的養(yǎng)護(hù)。同時(shí)，窖泥的成熟是一個(gè)連續(xù)動(dòng)態(tài)的過程，伴隨著各類微生物的此消彼長。當(dāng)前，連續(xù)的發(fā)酵以及不合理的養(yǎng)護(hù)容易造成窖泥板結(jié)和窖泥微生物衰亡，最終導(dǎo)致窖泥退化，生產(chǎn)出的白酒品質(zhì)不佳。目前已有關(guān)于大曲和糟醅群落演替的研究，也有對(duì)新窖泥前四輪次發(fā)酵的窖泥微生物演替分析，而對(duì)于窖池垂直維度的微生物群落結(jié)構(gòu)的解析和演替鮮有報(bào)道。本研究通過對(duì)安徽文王貢酒新老窖池不同深度的窖泥細(xì)菌微生物進(jìn)行分析，理清窖泥深度與其理化性質(zhì)、有機(jī)酸含量和窖泥微生物菌群結(jié)構(gòu)的相關(guān)關(guān)系，為窖泥的穩(wěn)定成熟及窖池的養(yǎng)護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

本實(shí)驗(yàn)所用窖泥樣品來自正常生產(chǎn)的安徽文王釀酒股份有限公司3年（new）和30年（old）窖池，采樣點(diǎn)經(jīng)緯度 33°04′N；115°15 ′E，采樣時(shí)間為 2020年12月。取樣示意圖如圖1所示，從池底3個(gè)位置取樣混合在一起進(jìn)行分析，每個(gè)采樣點(diǎn)分為0～2、2～4、4～6、6～8、8～10 cm 5 層，新窖泥標(biāo)注為 new_02～new_810；老窖泥標(biāo)注為 old_02～old_810。將采集樣品于均質(zhì)袋中充分混勻后置于4 ℃和-80 ℃冰箱，分別用于理化測定和高通量測序分析。

圖1 窖泥樣品取樣位置示意圖Fig.1 Schematic diagram of sampling location of pit mud samples

氟化銨、鹽酸、磷酸二氫鉀、氯化銨、重鉻酸鉀、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉、抗壞血酸（均為分析純）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；納氏試劑 上海源葉生物有限公司；氯化亞錫、鉬酸銨 上海麥克林生化科技有限公司；2-乙基丁酸 梯希愛（上海）化成發(fā)展有限公司；Fast DNASPIN試劑盒 美國MP Biomedicals。

PHS-25 pH計(jì) 海力辰邦西儀器科技有限公司；UV-500 PC紫外分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；7890 A氣相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；1525型液相色譜儀 沃特世科技（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 窖泥理化性質(zhì)分析 窖泥水分參考國標(biāo)GB 5009.3-2016采用烘干法；pH是將新鮮窖泥與去離子水按照1:5 g/mL混勻靜置后用pH計(jì)檢測；有效磷參考地標(biāo)DB 34T 2266-2014，采用氟化銨-鹽酸比色法測定；銨態(tài)氮根據(jù)納氏試劑比色原理，采用紫外分光光度法；腐殖質(zhì)參考地標(biāo)DB 34T 2265-2014，采用重鉻酸鉀氧化法測定。

有機(jī)酸的測定均采用相同的前處理方法，將新鮮窖泥與15%甲醇按照1:9 g/mL混勻，超聲處理20 min 再次混勻，8000 r/min 離心10 min，用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后測定有機(jī)酸。丁酸與己酸采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法定量，將前處理樣品加2-乙基丁酸作為內(nèi)標(biāo)，色譜柱采用 DB-Wax（Agilent 30 m×0.25 mm），進(jìn)樣量1 μL，柱流速1 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比30:1。升溫條件：初始溫度35 ℃，2 ℃/min升溫至 60 ℃，保持 4 min；6 ℃/min升溫至 195 ℃，保持20 min。氫火焰離子檢測器溫度250 ℃。乙酸與乳酸的測定采用高效液相色譜法，色譜柱采用Ultimate LP-C（Welch 4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測器采用Waters 2996二極管陣列檢測器，進(jìn)樣量15 μL，檢測波長210 nm。流動(dòng)相：磷酸二氫鉀緩沖液（0.01 mol/L，pH2.50）:甲醇=95:5，流速 0.6 mL/min。

1.2.2 窖泥微生物基因組的提取與高通量測序 將采集到的樣品用自封袋分裝后采用干冰轉(zhuǎn)運(yùn)，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行 Illumina MiSeq高通量測序。窖泥微生物總基因組DNA采用Fast-DNASPIN 試劑盒進(jìn)行提取，338F_（5’-ACTCCTAC GGGAGGCAGCAG-3’）與 806R_（5’-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3’），擴(kuò)增微生物 16S rRNA 基因的 V3～V4區(qū)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

原始測序數(shù)據(jù)采用 Flash（1.2.11）和 Fastp（0.19.6）進(jìn)行拼接和質(zhì)控，采用Mothur（1.30.2）進(jìn)行多樣性分析，采用QIIME軟件（V1.9.1）生成各分類學(xué)水平豐度表，多樣性距離計(jì)算，窖泥理化與樣本和微生物之間的冗余分析（RDA）分析借助美吉生信云平臺(tái)進(jìn)行分析，采用SPSS 25進(jìn)行單因素方差顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新老窖池窖泥理化性質(zhì)分析

窖泥的理化如表1所示，新老窖泥的含水量均隨窖泥深度增加而降低，pH隨窖泥深度增加而升高，除new_02窖泥含水量高于old_02外，同一深度的老窖泥中水分含量和pH高于新窖泥，該結(jié)果與前人研究相一致。表層窖泥含水量高、pH低的原因可能是此部分窖泥與呈酸性的黃水直接接觸，含水量高的窖泥致密性更強(qiáng)，厭氧效果也更好。老窖泥中的有效磷含量高于新窖泥，老窖池中有效磷含量隨窖泥深度增加先上升后下降，新窖池中的有效磷含量隨窖泥深度增加而增加。有效磷是微生物生長繁殖和代謝的必要元素，但含量控制在一定范圍（1.5～3.0 g/kg），過高的濃度可能會(huì)導(dǎo)致窖泥板結(jié)，影響窖泥微生物活動(dòng)致使窖泥退化，本次檢測的老窖池中有效磷含量適宜，新窖池中含量偏低，在新窖泥養(yǎng)護(hù)中應(yīng)適量添加含磷介質(zhì)。氨態(tài)氮的含量與窖泥質(zhì)量呈明顯正相關(guān)，在本文研究中發(fā)現(xiàn)老窖池中氨態(tài)氮含量遠(yuǎn)高于新窖泥，老窖池不同深度的窖泥中含量差異不明顯，在新窖池中隨窖泥深度增加而增加，新窖泥在深層質(zhì)量更好。腐殖質(zhì)是由微生物分解有機(jī)質(zhì)產(chǎn)生的，其含量可以用于判斷窖泥質(zhì)量，有學(xué)者對(duì)不同腐殖質(zhì)含量的窖泥在實(shí)際生產(chǎn)中進(jìn)行了驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)窖泥腐殖質(zhì)含量高低與所產(chǎn)的原酒中己酸乙酯含量有相關(guān)性，但在本研究中發(fā)現(xiàn)新老窖泥中腐殖質(zhì)含量均隨窖泥深度的增加而降低，并且各層之間差異顯著（＜0.05）。這可能是由于表層窖泥微生物與有機(jī)質(zhì)含量高糟醅直接接觸，代謝旺盛產(chǎn)生的，而深層窖泥有機(jī)質(zhì)含量較低。

表1 新老窖池池底窖泥理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of bottom pit mud from old and new pit cellar

窖泥中原核微生物可以產(chǎn)生各種有機(jī)酸。有機(jī)酸作為酯類物質(zhì)的底物，參與了糟醅中風(fēng)味化合物的形成。己酸、丁酸、乳酸和乙酸是濃香型白酒典型風(fēng)味物質(zhì)己酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和乙酸乙酯的前體物質(zhì)。隨窖泥深度的增加，有機(jī)酸的含量均降低。相比于乳酸和乙酸，新老窖池中不同深度窖泥中己酸和丁酸含量差異不明顯。根據(jù)Zhou等的研究，老窖池中有機(jī)酸代謝的途徑更為活躍，但新窖池中乳酸和乙酸含量明顯高于老窖池，這可能與新窖池中占據(jù)主導(dǎo)相關(guān)，乳酸含量的高低可以作為窖泥成熟的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 窖泥中原核微生物α多樣性指數(shù)分析

對(duì)所有測序序列進(jìn)行過濾，30個(gè)窖泥樣品的平均長度為416 bp。每個(gè)樣本的讀取次數(shù)從33172到68678。在97%的水平，所有優(yōu)質(zhì)序列分成4838 OTUs。樣本中優(yōu)質(zhì)序列的覆蓋率均大于99%，說明細(xì)菌微生物群落具有較好的代表性。

如表2所示，Shannon指數(shù)隨窖泥深度增加而增加，Simpson指數(shù)隨窖泥深度降低，表明越深層窖泥微生物多樣性越高；對(duì)比新老窖池發(fā)現(xiàn)，老窖池的微生物多樣性更高。老窖池物種豐富度（Chao指數(shù)、Ace指數(shù)和Sobs指數(shù)）隨窖泥深度增加，表層0～4 cm與深層4～10 cm存在顯著差異（＜0.05)；而新窖池表層0～2 cm物種豐富度最大，總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，但各層間無顯著性差異（＞0.05）。對(duì)比新老窖池的微生物豐富度可以看出，老窖池的層次較為分明，老窖池微生物豐度低于新窖池，這可能是超過30年的窖泥存在退化的原因。

表2 新老窖池池底窖泥原核微生物群落α多樣性指數(shù)Table 2 α-Diversity index of prokaryotic community in pit mud from old and new pit cellar

從多樣性可以看出，窖泥微生物的多樣性和豐度呈現(xiàn)出層次差異。如圖2所示，對(duì)新老窖池不同深度窖泥微生物的物種多樣性進(jìn)行組間非度量多維排列（NMDS）比較分析表明，老窖池0～4 cm和4～10 cm深度的窖泥微生物更緊密地聚集在一起；新窖池呈現(xiàn)相似的規(guī)律，但新窖池4～6 cm更趨向于過渡階段，在兩個(gè)分組中均有出現(xiàn)。

圖2 基于新老窖泥細(xì)菌群落Bray-Curtis相似性的NMDS排序Fig.2 NMDS ordination based on Bray-Curtis similarities of bacterial communities at old and new PM

2.3 窖泥中原核微生物門層面分析

如圖3A所示，在老窖泥樣品中微生物共檢出35個(gè)門，有18個(gè)門在所有深度中均存在。如圖3B所示，在新窖池中共檢測到43個(gè)門，有21個(gè)門在所有深度中均存在。如圖4所示，老窖泥中占比最高的是厚壁菌門（Firmicutes，78.25%），其次是擬桿菌門（Bacteroidota，10.06%），占比超過1%的還有互養(yǎng)菌門（Synergistota，4.02%）、Patescibacteria（2.4%）、Caldatribacteriota（1.45%）和放線菌門（Actinobacteriota，1.31%）。新窖泥中占比最高的也是厚壁菌門（Firmicutes，95.22%），其次是變形菌門（Proteobacteria，2.43%）和放線菌門（Actinobacteriota，1.75%）。隨窖泥深度的增加，微生物的門類也相應(yīng)增加。無論是老窖泥還是新窖泥，厚壁菌門始終在窖泥微生物群落中占據(jù)主導(dǎo)地位，該發(fā)現(xiàn)與前人研究相似。

圖3 新老窖池不同深度窖泥微生物門水平Veen圖Fig.3 Veen diagram of different depths new and old PM at phylum level

圖4 新老窖泥門水平物種占比情況Fig.4 The proportion of microbial in old and new PM at phylum level

2.4 窖泥中原核微生物屬層面分析

對(duì)老窖池的多樣性檢測發(fā)現(xiàn)，相比于新窖池，老窖池的微生物多樣性更高。進(jìn)一步對(duì)窖泥微生物群落屬層面的分析也進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)論，豐度占比超過0.01%的微生物有37種，而新窖池相對(duì)豐度占比0.01%只有16種。如圖5A所示，通過對(duì)比老窖泥不同深度的微生物占比發(fā)現(xiàn)，在淺層窖泥中占據(jù)主導(dǎo)地位，深層窖泥中和占據(jù)主導(dǎo)。和是重要的釀造功能菌。占比隨窖泥深度的增加而降低，在表面0～2 cm的窖泥中占比最高為41.29%，而深層窖泥中占比卻低于1%，與前人研究一致。屬的微生物占比隨窖泥深度增加先上升后下降，在4～6 cm的中層占比最高為23.9%。在6～8 cm窖泥中占比最高，為18.71%。根據(jù)前人的研究，和在窖泥成熟穩(wěn)定中扮演重要的角色，與乳酸呈負(fù)相關(guān)。新窖池占比超過0.01%的微生物有16個(gè)屬，如圖5B所示，乳酸菌（）在窖泥各個(gè)深度中所占比例最高，在表層2～4 cm窖泥中所占比例最高（74.7%），但其占比隨著窖泥深度的增加而下降。芽孢桿菌（）、梭菌（12）和的隨著深度的增加占比增加，成為深層窖泥微生物的優(yōu)勢(shì)菌群，這可能與深層窖泥的厭氧環(huán)境有關(guān)，有利于芽孢桿菌、梭狀芽胞桿菌等專性厭氧微生物的生存。在屬水平上，不同深度的微生物群落演替存在顯著差異，說明微生物群落在垂直方向上演替顯著。

圖5 新老窖池窖泥樣本與微生物菌群屬水平Circos圖Fig.5 Circos diagram for microflora structure in PM samples of old and new pit cellar at genus level

2.5 窖泥理化性質(zhì)與微生物樣本冗余分析

如圖6所示，RDA的結(jié)果分別解釋了老窖池54.00%和新窖池57.21%樣本與微生物理化的關(guān)系，新老窖池不同深度樣品對(duì)應(yīng)的理化具有相似的分布情況。新老窖池中淺層窖泥（0～4 cm）與理化因子水分、己酸、丁酸、乳酸和乙酸和腐殖質(zhì)正相關(guān)，深層窖泥（4～10 cm）與理化因子氨態(tài)氮、有效磷和pH正相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)與陶勇對(duì)2～50年不同窖齡窖泥與理化因子的相關(guān)性中有效磷、pH和氨態(tài)氮對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響相同。不同的是，老窖池淺層窖泥與微生物正相關(guān)，能夠促進(jìn)己酸的產(chǎn)生。有研究表明，隨窖齡增加其相對(duì)豐度增加。深層與微生物和正相關(guān)。新窖池淺層窖泥與微生物正相關(guān)，深層窖泥與微生物和12正相關(guān)。根據(jù)對(duì)窖泥微生物的研究，這兩類微生物參與窖泥的老化成熟。

圖6 窖泥理化指標(biāo)和微生物群落樣本冗余分析Fig.6 Redundancy analysis of physicochemical indexes and microbial community in pit mud

2.6 有機(jī)酸與窖泥微生物相關(guān)性分析

濃香型白酒有機(jī)酸中，己酸、丁酸、乳酸和乙酸構(gòu)成總酸的90%以上。窖池中產(chǎn)生有機(jī)酸的微生物主要來自窖泥，為了揭示窖泥中產(chǎn)有機(jī)酸微生物，本文用熱圖展現(xiàn)了有機(jī)酸與相對(duì)豐度排名前20的微生物屬間的Spearman相關(guān)系數(shù)。從圖7A可以看出，老窖池中微生物聚為2類，其中、與四種有機(jī)酸呈正相關(guān)，為老窖池中有機(jī)酸合成關(guān)鍵微生物。與己酸合成正相關(guān)的微生物有4種，分別是、、和。如圖7B所示，新窖池中與有機(jī)酸相關(guān)的微生物同樣聚為 2類，其中、和與除丁酸外的有機(jī)酸呈正相關(guān)，是新窖池中主要有機(jī)酸合成的關(guān)鍵微生物。主要代謝產(chǎn)物為己酸、丁酸、乙酸和氫氣，在新老窖池中均參與有機(jī)酸的生成。

圖7 窖泥有機(jī)酸與微生物相關(guān)性熱圖Fig.7 Heatmap of correlation between pit mud organic acid and microorganism

3 結(jié)論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測序分析了3、30年新老窖池不同深度窖泥的原核微生物群落演替，結(jié)合理化相關(guān)性分析，得到結(jié)論：新老窖池理化存在顯著差異，老窖池中水分、pH、有效磷、氨態(tài)氮含量普遍高于新窖池；新窖泥中乳酸和乙酸含量明顯高于老窖泥，乳酸含量的高低可以成為成熟窖泥的評(píng)價(jià)指標(biāo)。新老窖池微生物存在顯著差異，老窖池的微生物多樣性更高而豐富度低，和是老窖泥中的優(yōu)勢(shì)微生物 ，、和是新窖泥的優(yōu)勢(shì)微生物。垂直維度存在明顯群落演替。深度4 cm是區(qū)分表層深層的分界線；隨窖泥深度的增加，和成為老窖泥中優(yōu)勢(shì)微生物，和12成為新窖泥的優(yōu)勢(shì)微生物。新老窖泥理化關(guān)聯(lián)分析具有相似性，新老窖池深層窖泥與理化因子氨態(tài)氮、有效磷和pH均呈正相關(guān)；新老窖泥有機(jī)酸關(guān)聯(lián)分析具有差異性，、是老窖池中有機(jī)酸合成關(guān)鍵微生物，、和是新窖池中主要有機(jī)酸合成的關(guān)鍵微生物。

綜上，本研究系統(tǒng)測定了垂直維度不同深度新老窖池池底窖泥的理化與微生物菌群結(jié)構(gòu)，首次提出4 cm是區(qū)分窖泥深淺的分界線，并通過冗余分析闡明了不同深度樣本與理化因子的相關(guān)性，并與有機(jī)酸進(jìn)行關(guān)聯(lián)，找出了與有機(jī)酸生成相關(guān)的微生物，豐富了新老窖泥在垂直維度上的研究，對(duì)于指導(dǎo)窖泥養(yǎng)護(hù)和科學(xué)研究采樣具有一定現(xiàn)實(shí)意義。