劉秋梅，王澤富，劉振洋，孫欽秀, ，魏 帥，夏秋瑜，韓宗元，吉宏武,2，施文正，劉書(shū)成,2,

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋生物制品工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省海洋食品工程技術(shù)研發(fā)中心，水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江 524088；2.大連工業(yè)大學(xué)海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧大連 116034；3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

凡納濱對(duì)蝦（），又稱(chēng)南美白對(duì)蝦，是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)之一，多年來(lái)中國(guó)養(yǎng)殖產(chǎn)量居世界首位。凡納濱對(duì)蝦的加工主要以去頭或去殼后冷凍為主，在加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生40%～50%的副產(chǎn)物（蝦頭、蝦殼和蝦尾）；蝦頭又是凡納濱對(duì)蝦加工副產(chǎn)物的主要組成部分，占副產(chǎn)物的70%～80%。

蛋白質(zhì)是蝦頭中含量最多的營(yíng)養(yǎng)成分，約占蝦頭的12%～18%。在食品工業(yè)中，常采用生物酶解法利用蝦頭蛋白質(zhì)開(kāi)發(fā)生物活性肽和蝦類(lèi)調(diào)味品（蝦醬、蝦粉、蝦呈味基料）等，但在酶解過(guò)程中存在水解度低和蛋白質(zhì)利用率低的問(wèn)題。在實(shí)際生產(chǎn)中，通常選擇特異性的蛋白酶和優(yōu)化酶解條件來(lái)提高水解度和蛋白質(zhì)利用率，然而改變酶解底物蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)也是提高水解度和蛋白質(zhì)利用率的重要途徑之一。已有研究表明：蛋白質(zhì)在酶解處理之前進(jìn)行預(yù)處理適度變性，促使蛋白質(zhì)肽鏈逐漸伸展，能夠暴露出更多的酶切位點(diǎn)，從而增加水解度和提高蛋白質(zhì)利用率。熱處理是誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性常用的處理方法。適度熱處理，蛋白質(zhì)發(fā)生適度變性有利于酶解反應(yīng)；過(guò)度熱處理，蛋白質(zhì)過(guò)度變性反而會(huì)抑制酶解反應(yīng)。但是，如何表征蛋白質(zhì)的變性程度以及蛋白質(zhì)變性到什么程度最適于酶解反應(yīng)，目前還尚不明晰。因此，探索蛋白質(zhì)變性程度的定性和定量表征，有助于闡明蛋白變性程度對(duì)蛋白酶解特性影響的機(jī)理。為了獲得高水解度、高蛋白質(zhì)利用率的蝦頭酶解產(chǎn)品，可以通過(guò)控制加熱過(guò)程以防止過(guò)度變性和質(zhì)量劣化。

由于不同來(lái)源蛋白質(zhì)的理化特性和分子結(jié)構(gòu)有較大差異，蛋白變性情況也會(huì)存在較大差異。國(guó)內(nèi)外蛋白質(zhì)變性程度方法的研究：一是測(cè)定蛋白質(zhì)的理化特性如溶解度和熱力學(xué)特性等；二是測(cè)定分子結(jié)構(gòu)包括二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)等；三是建立蛋白變性模型以預(yù)測(cè)蛋白的變性程度。這些方法主要是定性地分析不同預(yù)處理后蛋白的變化趨勢(shì)，但直觀定量表征蛋白質(zhì)具體變性程度的研究較少。本研究以蝦頭中提取的混合蛋白為材料，在100 ℃加熱一定時(shí)間，分析蛋白質(zhì)溶解度、SDS-PAGE、圓二色譜和熒光光譜特征的變化，創(chuàng)新性地選擇部分特征數(shù)據(jù)指標(biāo)對(duì)蛋白質(zhì)變性程度進(jìn)行定性和定量表征，探索適合于表征蝦頭蛋白質(zhì)變性程度的快速直觀方法，為合理控制酶解過(guò)程、提高水解度和蛋白質(zhì)利用率提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活凡納濱對(duì)蝦，規(guī)格50～60尾/kg 湛江霞山水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)，利用海水充氧活運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室；考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；考馬斯亮藍(lán)染色液、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）預(yù)制膠、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer solution，10×PBS，pH7.4） 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

Chirascan V100圓二色光譜儀 英國(guó)Applied Photophysics公司；Varioskan Flash型全自動(dòng)酶標(biāo)儀

美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；RF-5301PC型熒光色譜儀 日本島津公司；DYY-11型電泳儀 北京市六一儀器廠；JYL-C022絞肉機(jī) 山東九陽(yáng)股份有限公司；FDU551型冷凍干燥機(jī) 日本東京理化器械株式會(huì)社；JXH-200恒溫混勻儀 上海凈信實(shí)業(yè)有限公司；Sigma3-30KS臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)sigma離心機(jī)有限公司；VOPADEST450型全自動(dòng)凱式定氮儀 中國(guó)廣州德資格哈特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蝦頭粗蛋白的提取 凡納濱對(duì)蝦頭粗蛋白的提取參考邵虎明的方法并略作改動(dòng)。在冰水中將凡納濱對(duì)蝦頭沿頭胸甲末端取下，控干水分，于4 ℃冰箱貯藏待用。取適量蝦頭用絞肉機(jī)絞碎（每絞15 s暫停10 s，防止溫度過(guò)高使蛋白變性）。取100 g絞碎蝦頭，按質(zhì)量體積比1:6加入0.1 mol/L pH7.4 PBS，在冰水浴中磁力攪拌 6 h，離心 20 min（4 ℃，10000 r/min）。將離心后的沉淀按質(zhì)量體積比1:4重新溶于PBS溶液，攪拌4 h后再次離心，合并兩次上清液，用紗布過(guò)濾除去雜質(zhì)得到蝦頭粗蛋白溶液。將蝦頭粗蛋白溶液直接冷凍干燥成蛋白粉于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 蝦頭蛋白熱處理

1.2.2.1 蝦頭粗蛋白濃度 凱式定氮法測(cè)定鮮蝦頭粗蛋白為16 g/100 g，提取的蝦頭粗蛋白溶液濃度約為12 g/100 g，其余為基質(zhì)蛋白和非蛋白氮。因此，蝦頭粗蛋白含量以12 g/100 g計(jì)（折算為約120 mg/mL）。在蝦頭酶解開(kāi)發(fā)活性肽或呈味基料時(shí)，通常按照料液質(zhì)量體積比（1:1、1:2、1:3）加水進(jìn)行酶解處理，加水后粗蛋白濃度分別約為60、40、30 mg/mL。為了與實(shí)際生產(chǎn)相一致，稱(chēng)取蝦頭蛋白粉，加入適量蒸餾水復(fù)溶，分別配制成蛋白含量為60、40、30 mg/mL的蝦頭粗蛋白溶液。

1.2.2.2 熱處理方法 取蝦頭粗蛋白溶液2 mL于試管中，置于100 ℃恒溫混勻儀分別加熱1、2、3、4、5、6、7、8 min后立即放入碎冰中冷卻平衡。將熱處理后的蝦頭粗蛋白溶液冷凍離心15 min（4 ℃，10000 r/min），取上清液用于測(cè)試蛋白質(zhì)的溶解度、SDS-PAGE、圓二色譜和熒光光譜。以未加熱處理的蝦頭粗蛋白溶液作為對(duì)照組。

1.2.3 溶解度測(cè)定 參考劉書(shū)成等的方法。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)熱處理后經(jīng)冷凍離心上清液中的蛋白質(zhì)濃度，蛋白溶解度用公式（1）計(jì)算：

式中： ρ為離心前蝦頭蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）；ρ為離心后上清液中蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。

由圖1A結(jié)果，定義未經(jīng)加熱處理的蝦頭蛋白為未變性狀態(tài)，蛋白溶解度為S；在100 ℃加熱4 min時(shí)（溶解度無(wú)顯著變化）為完全變性狀態(tài)，蛋白溶解度為 S；100 ℃加熱 0～4 min的蝦頭蛋白溶解度為S。用公式（2）表征蝦頭蛋白的變性程度Δ：

1.2.4 SDS-PAGE電泳分析 將1.2.2加熱處理后的蛋白質(zhì)溶液稀釋至1 mg/mL。取10 μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）和40 μL樣品混勻后沸水浴加熱 5 min，即為電泳樣品，上樣量為 15 μL。SDSPAGE：分離膠濃度12%，濃縮膠濃度4%，電極緩沖液（pH8.9）。電泳結(jié)束后，膠片用考馬斯亮藍(lán)染色液染色 90 min，再用脫色液（醋酸:無(wú)水乙醇:水=1:4:5）脫至條帶清晰。用10～180 kDa的分子量標(biāo)記校準(zhǔn)觀察，分析膠片中蛋白質(zhì)條帶變化。

灰度分析：將凝膠成像的電泳圖，用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。蛋白質(zhì)電泳條帶的相對(duì)灰度用公式（3）計(jì)算：

式中：A為未加熱處理蛋白質(zhì)電泳條帶的灰度值；B為加熱處理后蛋白質(zhì)電泳條帶的灰度值。

1.2.5 圓二色譜（Circular dichroism，CD）分析 采用Chirascan V100圓二色光譜儀進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。用去離子水將蛋白質(zhì)溶液的濃度調(diào)節(jié)至0.04 mg/mL，置于0.05 cm光徑的石英樣品池中，以100 nm/min在遠(yuǎn)紫外區(qū)（190～260 nm）進(jìn)行掃描，測(cè)蛋白質(zhì)的橢圓率。

1.2.6 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定 參考Sun等的方法并略作修改。用去離子水將蛋白質(zhì)溶液的濃度調(diào)節(jié)至0.04 mg/mL，用RF-5301PC型熒光色譜儀進(jìn)行掃描，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，掃描范圍300～450 nm，狹縫寬度為5 nm。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)重復(fù)3批次，每批次3個(gè)平行處理，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用JMP統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差和Tukey HSD多重比較分析，以95%置信水平確定差異顯著性；用Image J分析SDS-PAGE電泳條帶灰度；用Origin 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蝦頭蛋白溶解度與變性程度

溶解度在一定程度上可以代表總可溶性蛋白含量，也是蛋白質(zhì)變性程度的一個(gè)重要表征指標(biāo)。圖1A是不同濃度蝦頭蛋白在加熱過(guò)程中的溶解度變化。加熱前4 min，隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)，蝦頭蛋白的溶解度逐漸下降。因?yàn)榧訜崾沟鞍踪|(zhì)肽鏈展開(kāi)，包埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露，親水性基團(tuán)相對(duì)減少，蛋白質(zhì)疏水性增加，導(dǎo)致部分蛋白質(zhì)發(fā)生聚集沉淀，使蛋白溶解度降低。也有研究發(fā)現(xiàn)在熱處理過(guò)程中蛋白質(zhì)容易發(fā)生氧化，使蛋白質(zhì)交聯(lián)增加，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低。與未加熱蝦頭蛋白相比，加熱處理4 min時(shí)，蝦頭蛋白溶解度降低了約90%；在加熱時(shí)間4 min后，再延長(zhǎng)加熱時(shí)間，蝦頭蛋白的溶解度不再有顯著變化（＞0.05）。這主要是由于蝦頭的可溶性蛋白在加熱過(guò)程中逐漸變性沉淀，在加熱到4 min時(shí)可溶性蛋白變性沉淀達(dá)到最大值。羅嫚利用SDS-PAGE電泳圖譜得出豬肉蛋白經(jīng)過(guò)75 ℃水浴加熱3～5 min時(shí)接近完全變性，與本研究結(jié)果相似。

圖1 加熱過(guò)程中蝦頭蛋白溶解度（A）和變性程度（B）的變化Fig.1 Changes in the solubility (A) and denaturation degree (B)of shrimp head protein during heating

以溶解度表征蝦頭蛋白的變性程度，按照公式（2）計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)圖1B。在加熱0～4 min時(shí)，隨著加熱時(shí)間增加，蝦頭蛋白的變性程度顯著增加（＜0.05），在4 min時(shí)變性程度達(dá)到最大值；在加熱4 min以后，蝦頭蛋白的變性程度不再顯著增加且趨于平穩(wěn)（0.05），這說(shuō)明蝦頭蛋白在加熱4 min時(shí)已達(dá)到完全變性。

2.2 蝦頭蛋白SDS-PAGE電泳與變性程度

圖2中A、B和C分別為60、40、30 mg/mL蝦頭蛋白熱處理后的SDS-PAGE電泳圖譜。由圖2A、2B和2C可知，蝦頭蛋白的分子質(zhì)量分布在25～100 kDa，但主要集中在75 kDa附近。這說(shuō)明75 kDa附近的蛋白質(zhì)是蝦頭的主要蛋白，記75 kDa附近的電泳條帶區(qū)域?yàn)锳B帶。由圖2A、2B和2C可知，隨著加熱時(shí)間的增加，三種濃度蝦頭蛋白的電泳圖譜中AB帶的灰度均逐漸變淺，尤其在4 min后，AB帶的灰度不再有明顯變化。這說(shuō)明AB帶的蛋白質(zhì)在加熱過(guò)程中逐漸變性，在加熱4 min時(shí)達(dá)到完全變性。加熱處理會(huì)使蛋白質(zhì)變性聚集而沉淀，變性蛋白留在沉淀中，而電泳樣品是加熱處理后離心的上清液，因此變性蛋白的電泳條帶灰度會(huì)隨變性程度的增加而逐漸變淺，甚至消失。在本實(shí)驗(yàn)的加熱過(guò)程中，AB帶的灰度變化最明顯，因此可用AB帶來(lái)指示蝦頭蛋白加熱過(guò)程中的變性程度。

由圖2A、2B和2C可知，加熱過(guò)程中蛋白質(zhì)在SDS-PAGE圖譜中分子量約75 kDa附近的電泳條帶變化最明顯，將該區(qū)域條帶表示為AB。定義未經(jīng)加熱處理的蝦頭蛋白為未變性狀態(tài)，AB條帶的相對(duì)灰度值為AB；在100 ℃加熱4 min時(shí)（AB條帶完全消失）為完全變性狀態(tài)，AB條帶的相對(duì)灰度值為AB；100 ℃加熱0～4 min的蝦頭蛋白AB條帶相對(duì)灰度值為AB。用公式（4）表征蝦頭蛋白的變性程度 ΔSDS-PAGE：

以AB帶相對(duì)灰度值變化表征蝦頭蛋白的變性程度，按照公式（4）計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)圖2D。同一濃度下，在加熱1 min時(shí)，蝦頭蛋白變性程度出現(xiàn)負(fù)值，這是因?yàn)槌跏技訜崾共糠中》肿拥鞍祝ㄐ∮?5 kDa）發(fā)生聚集生成了約75 kDa的聚集體，從而使AB帶相對(duì)灰度值增加。加熱1～4 min時(shí)，蝦頭蛋白的變性程度顯著上升（＜0.05），在4 min時(shí)變性程度達(dá)到最大值，這是因?yàn)槌掷m(xù)加熱使蛋白質(zhì)變性聚集而沉淀。加熱4 min后，蝦頭蛋白的變性程度在最大值趨于平穩(wěn)（＞0.05）。這也說(shuō)明蝦頭蛋白在加熱4 min時(shí)已達(dá)到完全變性。

圖2 加熱過(guò)程中蝦頭蛋白的SDS-PAGE圖譜和變性程度的變化Fig.2 Changes in the SDS-PAGE and denaturation degree of shrimp head protein during heating

2.3 蝦頭蛋白圓二色譜與變性程度

圓二色光譜常用來(lái)表征蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，紫外區(qū)段（190～240 nm）的生色基團(tuán)主要是肽鏈。蛋白質(zhì)的-螺旋在190 nm出現(xiàn)正吸收峰，在208 nm和222 nm出現(xiàn)負(fù)吸收峰；-折疊在195 nm出現(xiàn)強(qiáng)正吸收峰，在216 nm出現(xiàn)負(fù)吸收峰；-轉(zhuǎn)角在180～190 nm出現(xiàn)強(qiáng)負(fù)吸收峰，在205 nm出現(xiàn)正吸收峰，在220～230 nm出現(xiàn)弱負(fù)吸收峰；無(wú)規(guī)則卷曲在198 nm附近出現(xiàn)負(fù)吸收峰，在220 nm附近出現(xiàn)小而寬的正吸收峰。

從未加熱蝦頭蛋白的圓二色譜圖（圖3A、3B、3C）可以看出，在190 nm附近有正吸收峰，在222 nm和208 nm附近有兩個(gè)弱的負(fù)吸收峰，這是-螺旋的特征吸收峰；在196 nm有正吸收峰，在216 nm有負(fù)吸收峰，這是-折疊的特征吸收峰。蝦頭蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以-螺旋和-折疊為主。隨著加熱時(shí)間的增加，190 nm的正吸收峰（-螺旋）逐漸消失并轉(zhuǎn)為190 nm 負(fù)吸收峰（-轉(zhuǎn)角），196 nm 的正吸收峰（-折疊）也逐漸消失并轉(zhuǎn)為強(qiáng)的負(fù)吸收峰（無(wú)規(guī)則卷曲）。這是因?yàn)榧訜崞茐牧说鞍踪|(zhì)分子內(nèi)氫鍵，暴露出分子內(nèi)的大量基團(tuán)如巰基和疏水基團(tuán)等，從而破壞了蝦頭蛋白原有的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使不同的二級(jí)結(jié)構(gòu)間發(fā)生了轉(zhuǎn)換，-螺旋向-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變，-折疊向無(wú)規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)變。

圖3 加熱過(guò)程中蝦頭蛋白圓二色譜和變性程度的變化Fig.3 Changes of the circle dichrosim and denaturation degree of shrimp head protein during heating

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)橢圓率的變化與變性程度之間存在著一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。由圖3A、3B和3C可知，定義未加熱蝦頭蛋白為未變性狀態(tài)，在196 nm的平均摩爾橢圓率為[θ]；100 ℃加熱5 min的蝦頭蛋白（橢圓率變化基本不顯著）為完全變性狀態(tài)，在196 nm的平均摩爾橢圓率為 [θ]；100 ℃ 加熱 0～5 min的蝦頭蛋白在196 nm的平均摩爾橢圓率為[θ]，用公式（5）表征蝦頭蛋白的變性程度 Δ:

由于蝦頭蛋白圓二色譜中196 nm處橢圓率的變化比較顯著，本實(shí)驗(yàn)用196 nm處橢圓率的變化來(lái)表征蝦頭蛋白的變性程度，按照公式（5）計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)圖3D。由圖3D可知，加熱前5 min，隨著加熱時(shí)間的增加，蝦頭蛋白變性程度顯著增加（0.05），當(dāng)加熱到5 min時(shí)蝦頭蛋白變性程度緩慢增加，加熱5～8 min蝦頭蛋白變性程度趨于平穩(wěn)。圓二色譜的完全變性時(shí)間與其他方法不同，這可能是因?yàn)槠茐牡鞍踪|(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)需要更多能量，所以完全變性時(shí)間發(fā)生滯后。

2.4 蝦頭蛋白內(nèi)源熒光與變性程度

蛋白質(zhì)分子中含有三種芳香族氨基酸殘基：色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）。在紫外光照射下芳香族氨基酸殘基會(huì)發(fā)射熒光，348 nm為T(mén)rp熒光峰，303 nm為T(mén)yr熒光峰，282 nm為Phe熒光峰，其中Trp熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。Trp的熒光強(qiáng)度和峰位置與蛋白質(zhì)構(gòu)象密切相關(guān)，特別是與Trp殘基所處的微環(huán)境有關(guān)。環(huán)境極性增加則發(fā)射峰紅移，疏水性增加則發(fā)射峰藍(lán)移，當(dāng)位于330～332 nm時(shí)表示Trp殘基處于疏水腔中，當(dāng)位于342 nm時(shí)表明Trp殘基部分處于疏水性環(huán)境中；當(dāng)位于350～352 nm時(shí)表示Trp殘基完全暴露于極性環(huán)境中，疏水腔瓦解，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)松弛。

從圖4A、4B和4C可以看出，未加熱蝦頭蛋白的內(nèi)源熒光在340～350 nm，說(shuō)明蝦頭蛋白的Trp殘基部分處于疏水性環(huán)境中；隨著加熱時(shí)間的增加，蝦頭蛋白的內(nèi)源熒光逐漸從340～350 nm移動(dòng)到了350～360 nm，發(fā)生了紅移，且熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。這是因?yàn)榧訜徇^(guò)程會(huì)破壞蝦頭蛋白的空間結(jié)構(gòu)，使肽鏈逐漸伸展，Trp殘基逐漸暴露在分子外部的極性環(huán)境中。

圖4 加熱過(guò)程中蝦頭蛋白內(nèi)源熒光和變性程度的變化Fig.4 Changes of the endogenous fluorescence and denaturation degree of shrimp head protein during heating

由圖4A、4B和4C，定義未加熱蝦頭蛋白為未變性狀態(tài)，熒光最大吸收峰的波長(zhǎng)為F；100 ℃加熱4 min時(shí)（相對(duì)紅移距離變化不顯著）為完全變性狀態(tài)，熒光最大吸收峰的波長(zhǎng)相對(duì)F的相對(duì)紅移距離為F；100 ℃加熱0～4 min蝦頭蛋白的熒光最大吸收峰相對(duì)紅移距離表征為F，用公式（6）表征蝦頭蛋白的變性程度Δ：

以波峰相對(duì)紅移距離為參考，按照公式（6）計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)圖4D。從圖4D中可以看出，在加熱前4 min，隨著加熱時(shí)間的增加，蝦頭蛋白變性程度顯著增大（0.05），在加熱4 min時(shí)蛋白變性程度達(dá)到最大，再增加加熱時(shí)間，蛋白變性程度也不再顯著變化（＞0.05）。這同樣說(shuō)明加熱4 min使蝦頭蛋白發(fā)生了完全變性。

2.5 不同表征方法的比較分析

對(duì)表征蝦頭蛋白變性程度的不同方法進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖5。從圖5可知，對(duì)相同濃度的蝦頭蛋白（圖5A、5B和5C），隨著加熱時(shí)間的增加，4種方法表征的蛋白變性程度均呈逐漸增加趨勢(shì)（＜0.05）；在加熱1～4 min之間時(shí)，蛋白變性程度都顯著增加（＜0.05），隨后再延長(zhǎng)加熱時(shí)間，蛋白變性程度均不再顯著變化（0.05）。四種蛋白變性表征方法在加熱1～4 min之間（即未達(dá)到完全變性之前），蛋白變性程度之間存在一些差異，溶解度法所表征的蛋白變性程度顯著性大于SDS-PAGE法、圓二色譜法和熒光光譜法（0.05），這是因?yàn)樗姆N蛋白變性表征方法采取的檢測(cè)原理不同。溶解度法檢測(cè)可溶性蛋白的變化，SDS-PAGE檢測(cè)分子量的變化，圓二色譜檢測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，熒光光譜檢測(cè)空間結(jié)構(gòu)的變化，且不同方法靈敏度不同，可以看出溶解度法的靈敏度高于其他方法。

圖5 不同濃度蛋白變性表征方法的比較Fig.5 Comparison of different concentration characterization methods for protein denaturation

以上結(jié)果表明，在同一表征方法中，不同濃度的蝦頭蛋白在加熱過(guò)程中變性程度呈S型上升趨勢(shì)，在加熱1～4 min之間時(shí)變性速率存在顯著差異（＜0.05）。在加熱1～4 min時(shí)（即未達(dá)到完全變性之前），60 mg/mL蝦頭蛋白的變性速率顯著慢于30 mg/mL和 40 mg/mL 蝦頭蛋白的（＜0.05），而 30 mg/mL 略高于40 mg/mL蝦頭蛋白的變性速率。這可能是因?yàn)樵谙嗤訜釛l件下，60 mg/mL溶液中蛋白含量較大，熱誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子聚集在一定程度上受到抑制，使蛋白質(zhì)變性程度降低。因此，蛋白質(zhì)濃度對(duì)蛋白質(zhì)完全變性時(shí)間無(wú)影響，但對(duì)蛋白變性速率有影響，選擇蝦頭蛋白濃度為30 mg/mL即料液比1:3時(shí)蝦頭蛋白可能會(huì)更快達(dá)到變性條件。

同時(shí)比較四種蝦頭蛋白變性程度表征方法的可操作性，溶解度法只需測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，具有快速、直觀、操作簡(jiǎn)單、測(cè)試廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，而SDS-PAGE法、圓二色譜法和熒光光譜法還需將濃度調(diào)至該方法適宜的范圍再進(jìn)行測(cè)定，且耗時(shí)長(zhǎng)、樣品使用量大，還需特定的儀器設(shè)備。

如上所述，在表征蝦頭蛋白變性程度時(shí)采用溶解度法更加方便快捷，并且考慮原料用量建議選擇料液比為1：3可能會(huì)更快達(dá)到變性條件。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明：溶解度法、SDS-PAGE法、圓二色譜法、熒光光譜法在定量直觀地表征加熱過(guò)程中蝦頭蛋白變性程度上具有一致性。在同一表征方法中，不同濃度的蝦頭蛋白在加熱過(guò)程中變性程度都呈S型上升趨勢(shì)，但在加熱1～4 min之間變性速率存在差異，其中蛋白溶解度的變性程度對(duì)加熱時(shí)間的靈敏度最為顯著。因此溶解度作為測(cè)定蝦頭蛋白變性程度的方法更加方便快捷，并且建議選擇料液比為1:3可能會(huì)更快達(dá)到變性條件。研究結(jié)果為食品加工過(guò)程中表征蛋白變性程度提供了方法參考。