孟珈同，邱智東，李軍鴿，王永春，唐秋竹

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新實(shí)踐中心·吉林長(zhǎng)春·130117）

甘草是藥食同源藥材，具有調(diào)和藥性、清熱解毒、潤(rùn)肺止痛的功效，并有“十方九草”的美譽(yù)[1]。古代甘草的炮制方法諸多，有炙、炒、炮、爁、焙、水炙、煨、蜜制、酒制、麩制、酥制、漿水制、膽汁制、醋制等[2]。但現(xiàn)2020版《中國(guó)藥典》收載的僅為甘草飲片、炙甘草兩種。炒甘草只收載于2005年版《河南省中藥飲片炮制規(guī)范》、2008年版《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》、2015年版《浙江省中藥飲片炮制規(guī)范》、2015年版《浙江省中藥飲片炮制規(guī)范》的地方標(biāo)準(zhǔn)中，且具體工藝參數(shù)不明確。而清炒甘草具有補(bǔ)中益氣，養(yǎng)正和中，調(diào)補(bǔ)胃氣，調(diào)和諸藥的作用，廣泛應(yīng)用于不同療效的古代名方中[3]。本研通過(guò)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化清炒甘草的炮制工藝，參照2020年版《中國(guó)藥典》甘草項(xiàng)下相關(guān)方法，建立炒甘草的炮制工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為炒甘草的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

高速裁斷往復(fù)式切藥機(jī)（富陽(yáng)康華制藥機(jī)械有限公司）；高精度超薄電子廚房秤（廣州市拓普電子科技有限公司）；小型炒藥機(jī)（MS-5型炒貨機(jī)）；中型炒藥機(jī)（H-系列性多功能電熱炒貨機(jī)）；高校液相色譜儀（島津2030）；盛藥盤；毛巾。

1.2 材料

甘草苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院 批號(hào)：111610-201908）；甘草酸銨（中國(guó)食品藥品檢定研究院批號(hào)：110731-202021）；甘草（甘草）對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院批號(hào)：120904-202021）；甘草藥材（產(chǎn)地：新疆墨玉縣224團(tuán)。批號(hào)XME-20200919），經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院翁麗麗教授鑒定為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisc.的干燥根和根莖，按照2020年版《中國(guó)藥典》一部甘草項(xiàng)下檢驗(yàn)，各項(xiàng)均符合規(guī)定。乙腈、甲醇均為色譜純；水為自制超純水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 切制

2.1.1 軟化

取XME-20200919批甘草，除去雜質(zhì)，搶水洗。將凈制后的甘草于室溫50℃、70℃、80℃下軟化至彎而不折即可。軟化時(shí)以濕布遮蓋，適當(dāng)噴灑清水，使藥材始終保持濕潤(rùn)。軟化后切4mm厚片，自然晾干。以藥材軟化時(shí)間、甘草苷與甘草酸含量、敗片率為指標(biāo)考察軟化溫度。

2.1.2 干燥

取軟化后XME-20200919批甘草藥材，切4mm厚片，分別于室溫40°C、60°C、80°C下干燥，以甘草苷及甘草酸含量、水分、干燥時(shí)間為指標(biāo)考察干燥溫度。

2.2 炒制

2.2.1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以炒制溫度、炒制時(shí)間和炒鍋轉(zhuǎn)數(shù)為考察因素。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，確定各因素水平，以炒甘草的性狀、甘草苷含量和甘草酸含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)對(duì)炒甘草的炮制工藝進(jìn)行優(yōu)選，因素水平見(jiàn)表1。選取XME-20200919批干燥后的甘草飲片9份，每份500g，按照正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案炒制甘草飲片，得到最佳工藝，L9（34）正交試驗(yàn)方案見(jiàn)表2。

表1 因素水平表

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)方案

2.3 炮制工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

分別取甘草藥材3份，每份500g，按照上述最佳炮制工藝驗(yàn)證。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 軟化溫度結(jié)果

室溫軟化時(shí)間長(zhǎng)，藥材易發(fā)霉，且藥材硬芯較多，不利于切制。熱潤(rùn)法時(shí)間短，敗片率低，且加熱對(duì)甘草含量影響不大，因此選擇熱潤(rùn)法軟化甘草。結(jié)合節(jié)約能源等方面考慮，選擇70℃熱潤(rùn)軟化甘草，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 軟化溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2 干燥溫度結(jié)果

干燥溫度對(duì)甘草飲片性狀及甘草苷、甘草酸含量影響不大。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)情況和經(jīng)濟(jì)成本，可選擇自然晾干。

表4 干燥溫度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

炒甘草性狀以甘草飲片表皮顏色呈深褐色，切面顏色深黃色且顏色均勻，部分飲片微具焦斑，具焦香氣為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)性狀打分。炒甘草性狀為判斷樣品是否符合要求的首要條件，在性狀合格的基礎(chǔ)上，通過(guò)甘草苷和甘草酸的含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步確定清炒條件。因此，性狀、甘草苷含量和甘草酸含量的權(quán)重系數(shù)分配為0.50、0.25、0.25。按公式（1）計(jì)算綜合評(píng)分（Y）[4]。式中Y1為性狀得分結(jié)果，Y2為甘草苷含量測(cè)定結(jié)果，Y3為甘草酸含量測(cè)定結(jié)果，Ymax為各項(xiàng)結(jié)果中最大值。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5-6。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 正交實(shí)驗(yàn)方差分析

由表5-6可知，各因素影響程度依次為炒制溫度＞炒鍋轉(zhuǎn)數(shù)＞炒制時(shí)間。其中炒制溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而炒制時(shí)間、炒鍋轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。炒制溫度（A）：A2＞A3＞A1，炒制時(shí)間（B）：B2＞B1＞B3，為保證炒制時(shí)的均勻性，選擇炒鍋轉(zhuǎn)數(shù)（C）為C3即可，因此確定最佳工藝為A2B2C3，即150℃清炒25 min，炒鍋轉(zhuǎn)數(shù)為20 rpm/min。

3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4 炒甘草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

4.1 性狀

本品呈類圓形或橢圓形的厚片。外表皮深紅棕色或深褐色，具縱皺紋。切面顯深黃色，微具焦斑，略顯纖維性，有明顯放射狀紋理及形成層環(huán)。質(zhì)堅(jiān)實(shí)，具粉性。氣微，味甜而特殊。

4.2 薄層色譜

參照2020版《中國(guó)藥典》一部甘草薄層鑒別方法對(duì)批號(hào)為XME-20200919的炒甘草樣品進(jìn)行薄層鑒別。在供試品色譜中，斑點(diǎn)清晰，分離度好，在與對(duì)照藥材色譜與對(duì)照品色譜中相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 炒甘草薄層鑒別色譜圖

4.3 水分與總灰分

取10批炒甘草供試品，照《中國(guó)藥典》2020年版四部通則2302與通則0832第二法烘干法測(cè)定。平均水分為3.3%，炒甘草飲片水分不得過(guò)5.0%。平均總灰分為3.7%，炒甘草飲片總灰分不得過(guò)5.0%。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 炒甘草水分、總灰分測(cè)定結(jié)果

4.4 甘草苷和甘草酸含量測(cè)定

4.4.1 色譜條件

色譜柱Venusil MP C18（4.6×250mm，5μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～8 min，A：19%；8～35 min，A：19%～50%；35～36min，A：50%～70%；36～40 min，A：70%）；流速：1.0 mL/min；波長(zhǎng)：237 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

4.4.2 對(duì)照品溶液的制備

參考2020年版《中國(guó)藥典》一部甘草【含量測(cè)定】的對(duì)照品溶液制備方法。

4.4.3 供試品溶液的制備

參考2020年版《中國(guó)藥典》一部甘草【含量測(cè)定】的供試品溶液制備方法。對(duì)照品和炒甘草液相圖見(jiàn)圖2。

圖2 炒甘草及對(duì)照品高效液相色譜圖

4.4.4 線性關(guān)系考察

分別配濃度為0.02mg/ml、0.06mg/ml、0.10mg/ml、0.14mg/ml、0.2mg/ml的甘草苷對(duì)照品溶液，及濃度為0.10mg/ml、0.30mg/ml、0.50mg/ml、0.70mg/ml、1.0mg/ml

甘草酸對(duì)照品溶液。精密吸取上述不同濃度對(duì)照品溶液10μL，注入液相色譜儀。以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。甘草苷：Y=1950735X-2830.4，r=0.9999，在0.02～0.24μg內(nèi)線性關(guān)系良好；甘草酸銨：Y=423098X-1124.2，r=0.9999，在0.12～1.17μg內(nèi)線性關(guān)系良好。

4.4.5 精密度試驗(yàn)

取供試品溶液，按4.4.1項(xiàng)下方法連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得甘草苷和甘草酸含量的RSD分別為0.4%和0.3%，表明儀器精密度良好。

4.4.6 重復(fù)性試驗(yàn)

按4.4.3項(xiàng)下方法制備同一批次6份供試品溶液，按4.4.1項(xiàng)下方法測(cè)定，測(cè)得甘草苷和甘草酸含量的RSD分別為2.49%和2.95%，RSD＜3%，表明此方法重復(fù)性良好。

4.4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取炒甘草供試品溶液，分別在0h、8h、12h、18h、24h按4.4.1項(xiàng)下方法測(cè)定甘草苷及甘草酸含量。測(cè)得甘草苷和甘草酸含量的RSD分別為0.6%和0.3%，表明該方法在24小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。

4.4.8 加樣回收率試驗(yàn)

取同一供試品（批號(hào)XME-20200919含量：甘草苷：7.4351mg/g甘草酸：30.9011mg/g）6份，每份約0.1g，精密稱定，分別精密加入以70%乙醇制備對(duì)照品溶液100ml，對(duì)照品濃度為甘草苷0.0083mg/ml，甘草酸0.0340mg/ml，按照4.4.3方法制備，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表9。表明本方法準(zhǔn)確度符合要求。

表9 加樣回收率結(jié)果

4.4.9 甘草苷和甘草酸含量

稱取10批甘炒甘草樣品，每批精密稱定2 g，按4.4.3方法制備供試品溶液，按4.4.1方法測(cè)定甘草苷與甘草酸含量。10批樣品甘草苷平均轉(zhuǎn)移率為102.53%，2020年版《中國(guó)藥典》中甘草藥材中甘草酸含量限度規(guī)定不得低于0.50%，按90%轉(zhuǎn)移率計(jì)算，甘草苷（C21H22O9）不得少于0.45%；甘草酸平均轉(zhuǎn)移率為99.08%，2020年版《中國(guó)藥典》中甘草藥材中甘草酸含量限度規(guī)定不得低于2.0%，按90%轉(zhuǎn)移率計(jì)算，甘草酸（C42H62O16）不得少于1.8%。結(jié)果見(jiàn)表10。

表10 10批藥材甘草苷含量測(cè)定結(jié)果及炒甘草飲片轉(zhuǎn)移率

5 結(jié)果與討論

生品甘草性平、味甘，具有和中緩急、調(diào)和諸藥的功效，在臨床中應(yīng)用廣泛[5]。而炒甘草則是將甘草輕微炭化，從而增加了止血、降糖、抗?jié)?、保肝、抗炎等功效[6]。張仲景所著古代醫(yī)學(xué)著作《傷寒雜病論》中應(yīng)用炙甘草的藥方多達(dá)68個(gè)，此炙甘草即為今炒甘草[7]，可見(jiàn)其應(yīng)用的廣泛性。本研究建立了甘草飲片切制工藝及最佳炒甘草炮制工藝：取甘草藥材，除去雜質(zhì)，搶水洗凈。將甘草藥材置適宜容器內(nèi)，以濕布遮蓋，70℃加熱悶潤(rùn)，潤(rùn)透即止，切4mm厚片，自然晾干。將晾干后的飲片于炒藥機(jī)中150℃炒制25min，炒鍋轉(zhuǎn)數(shù)為20 rpm/min。炒甘草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為：飲片表皮呈深褐色，切面顏色深黃色且顏色均勻，部分飲片微具焦斑，具焦香氣。水分不得過(guò)5.0%，總灰分不得過(guò)5.0%，甘草苷（C21H22O9）含量不得少于0.45%，甘草酸（C42H62O16）含量不得少于1.8%。綜上，本研究制訂的炒甘草最佳炮制工藝科學(xué)合理、穩(wěn)定可行，可為炒甘草的生產(chǎn)、質(zhì)量控制及古代名方制劑開發(fā)提供參考。