許明軍， 毛健梅， 習(xí) 陽(yáng)

(寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所， 浙江寧波 315211)

胞紅蛋白(cytoglobin，CYGB)，又名星狀細(xì)胞激活蛋白 (stellate cell activating protein, STAP)，在2001年被發(fā)現(xiàn)于肝星狀細(xì)胞中，其對(duì)于肝細(xì)胞的損傷修復(fù)具有重要的調(diào)控作用[1]。由于CYGB的結(jié)構(gòu)與血紅蛋白、肌紅蛋白、腦紅蛋白等珠蛋白相似，通過(guò)位于卟啉環(huán)中心的血紅素鐵對(duì)分子氧具有高親和力，因此CYGB也被稱作珠蛋白家族第四成員[2]。CYGB具有儲(chǔ)存和運(yùn)輸氧氣、調(diào)節(jié)活性氧/活性氮(reactive oxygen/nitrogen species, ROS/RNS)、缺氧脅迫環(huán)境下的細(xì)胞保護(hù)和腫瘤抑制等功能[3, 4]。CYGB在許多人類惡性腫瘤中普遍表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)CYGB抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[5]。我們之前的研究結(jié)果顯示，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，CYGB通過(guò)p53-YAP1-ACSL4軸促進(jìn)鐵死亡抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[6]。

細(xì)胞鐵死亡是一種新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡方式，被定義為一種鐵依賴性的、以脂質(zhì)過(guò)氧化物積累為特征的、非凋亡形式的細(xì)胞死亡[7]。鐵死亡與其他調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡中的細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬、細(xì)胞焦亡等在形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)和代謝組學(xué)等方面存在明顯區(qū)別[8]。雖然鐵死亡最初在篩選癌癥治療藥物中被發(fā)現(xiàn)，隨著鐵死亡逐漸進(jìn)入研究者的視野，目前鐵死亡已經(jīng)在神經(jīng)性退行性疾病、缺血再灌注損傷和心血管等疾病中被發(fā)現(xiàn)[9-11]，探索調(diào)控鐵死亡的相關(guān)機(jī)制對(duì)于疾病的預(yù)防或治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

1 細(xì)胞鐵死亡

細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡失調(diào)是細(xì)胞鐵死亡的重要誘因，脂質(zhì)過(guò)氧化物堆積引起細(xì)胞膜損傷是細(xì)胞鐵死亡的主要特征之一。細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)活性氧及代謝物丙二醛和4-羥基壬烯醛、谷胱甘肽(glutathione，GSH)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4 (glutathione peroxidase 4，GPX4)等含量及活性的改變是評(píng)價(jià)細(xì)胞鐵死亡的重要指標(biāo)[12]。細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生及可能的調(diào)控機(jī)制見(jiàn)Fig.1。

Fig.1 Diagram of regulatory mechanism of cell ferroptosis and its association with CYGB The regulation of ferroptosis by multiple pathways resulting in the oxidation of polyunsaturated fatty acid (PUFA) to produce lipid peroxide (LPO), which destroys cell membrane and induces cell death. Oxidation of PUFA mediated by acyl-CoA synthetase long-chain family member 4 (ACSL4) and lysophosphatidyl choline acyltransferase 3 (LPCAT3) is required for phospholipid peroxidation and ferroptosis. Cellular iron, which is imported by transferrin receptor (TFR), is an essential factor of ferroptosis and the autophagy-dependent degradation of ferritin (ferritinophagy). Cellular accumulated reactive oxygen species (ROS), mainly produced within the mitochondrion, react with free iron by Fenton reaction to produce hydro peroxide (·OH), which contributes to LPO production. p53 is a key regulator by activating the YAP1-mediated transcription of TFR and ACSL4 and suppressing the system Xc- for the import of cysteine, and the reduction of glutathione (GSH) results in low activity of glutathione peroxidase 4 (GPX4) to scavenge LPO. CYGB can activate p53, promote heme oxygenase 1 (HO-1) mediated heme degradation, and scavenge excessive nitric oxygen (NO) for ONOO- production

鐵離子代謝及其誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧在鐵死亡中扮演非常重要角色[13, 14]。胞外鐵離子與轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin, TF)結(jié)合形成TF-Fe3+復(fù)合物，通過(guò)細(xì)胞膜表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(transferrin receptor, TFR)被轉(zhuǎn)移到胞內(nèi)。隨后，在鐵還原酶前列腺跨膜上皮抗原3(six-transmembrane epithelial antigen of prostate 3，STEAP3)的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)镕e2+，由鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(divalent metal-ion transporter 1，DMT1)將Fe2+聚集形成可變鐵池(labile iron pool，LIP)，多余的鐵則通過(guò)細(xì)胞膜上的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferroportin，F(xiàn)PN)被分泌到細(xì)胞外。細(xì)胞內(nèi)的鐵除了被用于氧化呼吸和酶促反應(yīng)外，還能被儲(chǔ)存在鐵蛋白(ferritin，F(xiàn)t)中。鐵蛋白是一種具有鐵氧化酶活性的鐵存儲(chǔ)蛋白質(zhì)，能夠?qū)⒉环€(wěn)定Fe2+轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定Fe3+[10, 13]。一方面，增加自噬誘導(dǎo)鐵蛋白的降解，即鐵蛋白自噬(ferritinophagy)能使Fe2+上升。另一個(gè)方面，由核相關(guān)因子(nuclear factor erythroid 2 like 2，NRF2)調(diào)控的血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)的激活也能促使胞內(nèi)血紅素轉(zhuǎn)化出更多的Fe2+。而高濃度游離的Fe2+與H2O2兩者間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生羥自由基，即芬頓反應(yīng)，能使膜磷脂中的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)雙烯丙基處發(fā)生鏈?zhǔn)窖趸D(zhuǎn)變?yōu)橹|(zhì)過(guò)氧化物(lipid peroxide, LPO)[13, 14]。持續(xù)的脂質(zhì)過(guò)氧化可直接損傷細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙和細(xì)胞死亡。因此，由Fe2+引發(fā)的芬頓反應(yīng)所產(chǎn)生的羥自由基，是造成細(xì)胞氧化損傷誘導(dǎo)鐵死亡的一個(gè)非常重要原因。然而，鐵除了通過(guò)芬頓反應(yīng)自發(fā)誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化，也可通過(guò)激活脂氧合酶的酶促反應(yīng)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化物[14]。細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸通過(guò)氧化劑或者氧化酶類催化生成脂質(zhì)過(guò)氧化物，是鐵死亡的一個(gè)重要特征。首先，多不飽和脂肪酸的生物合成受長(zhǎng)鏈?；o酶A合酶4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4，ACSL4)和溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶3(lysophosphatidylcholine acyltransferase 3，LPCAT3)的調(diào)節(jié)，生成的多不飽和脂肪酸因含有雙鍵易在氧化劑，例如過(guò)氧化氫、羥基自由基、超氧離子等活性氧存在下被氧化生成脂質(zhì)過(guò)氧化物[15]。當(dāng)膜上的多不飽和脂肪酸被過(guò)氧化后，其移動(dòng)能力、通透性、或者與之結(jié)合的分子受到影響導(dǎo)致功能改變進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡。GPX4可特異并高效地清除磷脂過(guò)氧化氫，從而抑制鐵死亡。GPX4完成抗氧化作用需要消耗GSH，后者由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成。其中, 半胱氨酸的來(lái)源胱氨酸的吸收被認(rèn)為是谷胱甘肽合成的限速步驟。由跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC7A11(solute carrier family 7 member 11)和SLC3A2 (solute carrier family 3 member 2)組成的胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體System Xc-，可介導(dǎo)細(xì)胞外胱氨酸流入[16]。p53蛋白被認(rèn)為是調(diào)控逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體System Xc-開(kāi)關(guān)和細(xì)胞鐵死亡的重要分子。p53 通過(guò)直接結(jié)合SLC7A11基因啟動(dòng)子，并抑制其表達(dá)來(lái)減少外源胱氨酸的攝入，促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡[17]。

新近研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡是癌癥治療的一種有效方式[16]。胰腺癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱耐藥被認(rèn)為是胰腺癌治療困難的重要原因，而抑制GPX4基因表達(dá)則可逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)吉西他濱耐藥，加速癌細(xì)胞死亡[18]。Erastin聯(lián)合索拉非尼，可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度增高，通過(guò)芬頓效應(yīng)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧，導(dǎo)致脂質(zhì)氧化水平升高，進(jìn)而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。同樣，Erastin聯(lián)合順鉑能提高順鉑對(duì)癌細(xì)胞的殺傷力[19]。在心血管疾病方面，F(xiàn)ang等[20]報(bào)道，心肌細(xì)胞中由NRF2介導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡是心血管功能喪失的一個(gè)重要原因。在肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)激活及纖維化中，誘導(dǎo)p53介導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡可以改善纖維化[21]。說(shuō)明鐵死亡不僅在癌癥的治療，而且在纖維化，心血管疾病及代謝性疾病等的防治方面逐漸受到關(guān)注。

2 胞紅蛋白

人CYGB由190個(gè)氨基酸組成，分子量為21 kD，主要以單體形式存在[1]。作為典型的珠蛋白，CYGB蛋白質(zhì)核心區(qū)154個(gè)氨基酸殘基(18～171位)構(gòu)成非極性腔，通過(guò)G、H螺旋間狹長(zhǎng)的縫隙與外部相連，是血紅素?cái)U(kuò)散通路和配基臨時(shí)結(jié)合部位，同時(shí)也是O2進(jìn)出通道。CYGB由4個(gè)吡咯環(huán)，通過(guò)4個(gè)甲炔基相連形成環(huán)狀，鐵離子居于環(huán)中。血紅素鐵中的6個(gè)配位鍵中4個(gè)與吡咯環(huán)的N配位結(jié)合，1個(gè)與近端的F8位組氨酸殘基His結(jié)合，第6個(gè)配位鍵被E7位的His殘基占據(jù)，外源性氣體型配體需要和His E7競(jìng)爭(zhēng)，才能結(jié)合到CYGB。因此，推測(cè)CYGB除了攜帶和運(yùn)送氧氣，還可進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)作用[2, 22]。

CYGB被認(rèn)為是一個(gè)氧化還原狀態(tài)敏感蛋白質(zhì)[2]。Fe2+-CYGB與氧的親和性較高。但在缺氧條件下，轉(zhuǎn)變?yōu)镕e3+-CYGB。在CYGB氨基酸序列中具有2個(gè)半胱氨酸殘基(Cys38和Cys83)，能夠在氧化狀態(tài)下形成分子內(nèi)部的二硫鍵(S-S)。因此，當(dāng)可獲取的氧的狀態(tài)發(fā)生變化時(shí)，在CYGB內(nèi)部的2個(gè)Cys會(huì)形成S-S，主要以Fe3+-CYGB(S-S)狀態(tài)存在。此時(shí)，其對(duì)氧的親和性下降。外源性配體結(jié)合CYGB，改變其空間結(jié)構(gòu)，引起生物活性及下游信號(hào)通路的變化[23]。CYGB能結(jié)合生物膜上脂質(zhì)，例如線粒體內(nèi)膜上心磷脂，推測(cè)CYGB能增強(qiáng)脂質(zhì)過(guò)氧化，影響線粒體功能[24]。事實(shí)上，當(dāng)HSC激活時(shí)，細(xì)胞內(nèi)CYGB表達(dá)上升，ROS含量和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增加。而CYGB被敲除后，這一現(xiàn)象得到顯著緩解[25]。綜上所述，當(dāng)機(jī)體或者細(xì)胞處于氧化脅迫狀態(tài)時(shí)，CYGB將參與細(xì)胞內(nèi)的ROS調(diào)控及脂質(zhì)活性氧代謝過(guò)程。

CYGB最初被稱為星狀細(xì)胞激活相關(guān)蛋白質(zhì)，是HSC纖維化進(jìn)程中被激活的一種蛋白質(zhì)[2]。而胞內(nèi)過(guò)氧化氫，脂質(zhì)過(guò)氧化等活性氧物質(zhì)累積是HSC纖維化的重要特征。在纖維化進(jìn)程中，大量堆積的脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物能被維生素E(vitamin E)、GSH、線粒體靶向超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、Mito-TEMPO等鐵死亡抑制劑顯著降低。我們的研究也表明，CYGB過(guò)表達(dá)后，調(diào)控腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡的敏感性，說(shuō)明CYGB在調(diào)控細(xì)胞鐵死亡方面具有不可忽視的作用。

3 胞紅蛋白與腫瘤細(xì)胞鐵死亡調(diào)控

人CYGB為單拷貝基因，定位于抑癌基因富含區(qū)的染色體17q25 。近期研究表明，CYGB是抑癌基因，對(duì)維持組織器官的正常功能具重要影響[2]。小鼠cygb敲除(cygb-/-)后，在4到11個(gè)月年齡段，26%個(gè)體出現(xiàn)心肌肥大、腎和子宮囊腫、肝纖維化和淋巴瘤等疾病；而1年以上老齡小鼠中，約70%以上出現(xiàn)多個(gè)組織器官，例如肺部、肝、腸、腎及淋巴組織的自發(fā)性腫瘤[26]。在臨床樣本中，有研究報(bào)道，CYGB基因在乳腺癌細(xì)胞中受到甲基化影響而呈現(xiàn)低表達(dá)水平，恢復(fù)CYGB的表達(dá)可導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖、遷移和腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)基因的下調(diào)[27, 28]。肺癌細(xì)胞中CYGB表達(dá)受到ΔNp63正調(diào)控，能抵抗ROS帶來(lái)的凋亡，Kaplan-Meier生存曲線分析表明，ΔNp63-CYGB共同高表達(dá)的肺癌患者具有更低的生存率[29]。

Thuy le等[26]發(fā)現(xiàn)，cygb-/-小鼠更易被N-二乙基亞硝胺誘導(dǎo)發(fā)生腫瘤，并且在肝和肺組織中出現(xiàn)更多γH2AX陽(yáng)性細(xì)胞；另一方面，cygb轉(zhuǎn)基因小鼠能減少硫代乙酰胺給肝帶來(lái)的損傷，說(shuō)明了CYGB在抗氧化中的保護(hù)作用[2]。Fang等[30]在研究人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)，用抗霉素A作為線粒體呼吸鏈的抑制劑時(shí),CYGB缺陷的細(xì)胞H2O2含量更高, 而在CYGB過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中H2O2含量則顯著降低，進(jìn)一步說(shuō)明，CYGB在去除ROS方面的功能。本文最近的研究發(fā)現(xiàn)，CYGB在腸癌細(xì)胞中具有低表達(dá)水平，而當(dāng)過(guò)表達(dá)CYGB后，癌細(xì)胞生長(zhǎng)得到抑制，線粒體膜電位受損，細(xì)胞脂質(zhì)活性氧上升，且對(duì)細(xì)胞鐵死亡誘導(dǎo)劑更加敏感。通過(guò)測(cè)序分析及對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中CYGB表達(dá)差異的基因富集后信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，CYGB能調(diào)控Hippo信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子Yes1相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白(Yes1 associated transcriptional regulator，YAP1)，進(jìn)而促進(jìn)下游ACSL4表達(dá)，提升多不飽和脂肪酸含量和促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡；且我們同時(shí)也證實(shí)，CYGB能提升p53表達(dá)水平[6]。而p53是調(diào)控細(xì)胞鐵死亡的一個(gè)重要基因，其激活導(dǎo)致SLC7A11表達(dá)下調(diào)，從而抑制System XC-轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的功能并誘導(dǎo)鐵死亡。事實(shí)上，有報(bào)道證實(shí)，CYGB能直接結(jié)合p53，阻斷其泛素化和隨后的降解, 延長(zhǎng)了p53的半衰期[31]。

誘導(dǎo)細(xì)胞死亡是癌癥治療的關(guān)鍵問(wèn)題。盡管化學(xué)藥物治療取得了較大成功，但大多數(shù)癌細(xì)胞都能獲得一定的耐藥性，進(jìn)而減弱治療效果。在肝癌[32]、肺癌[19]、腸癌[6]和乳腺癌[33]等癌細(xì)胞中，引發(fā)鐵死亡被認(rèn)為是一種有效治療方式。而對(duì)大多數(shù)癌基因或抑癌基因的調(diào)控都能影響細(xì)胞鐵死亡。p53蛋白是影響細(xì)胞癌變的重要分子，在調(diào)控細(xì)胞鐵死亡中具有重要作用。一方面，p53能下調(diào)SLC7A11表達(dá)，抑制逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體System Xc-開(kāi)關(guān)、使胞內(nèi)GSH耗竭引起癌細(xì)胞鐵死亡[12, 17]；另一方面，p53也能激活精脒/精胺N1乙酰基轉(zhuǎn)移酶1(spermidine/spermine N1-acetyltransferase 1，SAT1)的轉(zhuǎn)錄來(lái)促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化，進(jìn)而促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞鐵死亡發(fā)生[34]。作為Hippo信號(hào)通路中關(guān)鍵因子，YAP1因被磷酸化而滯留在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，降低其細(xì)胞核活性。但在受到鐵死亡誘導(dǎo)劑處理時(shí)，核內(nèi)YAP1活性明顯增強(qiáng)，促進(jìn)靶基因TFR和ACSL4的表達(dá)，加速細(xì)胞鐵死亡[35]。對(duì)影響鐵死亡的重要因子的調(diào)控是增進(jìn)癌癥治療效果的一種重要手段。

綜合前面的研究表明，CYGB具有調(diào)控細(xì)胞內(nèi)ROS水平和氧化還原平衡，以及與膜上脂質(zhì)結(jié)合的特性。同時(shí)，我們也證實(shí)，CYGB對(duì)細(xì)胞鐵死亡重要調(diào)控因子，例如p53、YAP1具有調(diào)控作用。鑒于小鼠CYGB敲除后多個(gè)組織器官的自發(fā)性腫瘤發(fā)生，因此，靶向CYGB同時(shí)結(jié)合細(xì)胞鐵死亡誘導(dǎo)將會(huì)是清除腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要研究關(guān)注點(diǎn)。

4 胞紅蛋白與細(xì)胞鐵死亡和心血管疾病

一氧化氮(nitric oxide，NO)是調(diào)節(jié)血管張力的重要信號(hào)分子。內(nèi)源性的NO由L型精氨酸在內(nèi)皮細(xì)胞的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化下產(chǎn)生，隨后進(jìn)入血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)[36]。正常生理?xiàng)l件下，NO結(jié)合到可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶，催化GTP產(chǎn)生環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷，進(jìn)而調(diào)節(jié)胞內(nèi)Ca2+濃度和流動(dòng)，引起VSMC舒張[3]。

NO失調(diào)不僅能影響平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及死亡，也與機(jī)體的疾病狀態(tài)，例如高血壓、糖尿病及動(dòng)脈粥樣硬化緊密相關(guān)[37]。而疾病狀態(tài)下，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生更多的ROS物質(zhì)。NO能與ROS物質(zhì)超氧陰離子(O2.-)反應(yīng)，生成更具有毒性的ONOO-，引起蛋白質(zhì)中酪氨酸的硝基化。一方面，ONOO-可負(fù)反饋調(diào)控四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin，BH4)與內(nèi)皮型NOS偶聯(lián)并阻止其合成。而B(niǎo)H4的減少，又能促進(jìn)線粒體內(nèi)ROS堆積，破壞線粒體功能；另一方面，ONOO-抑制線粒體呼吸鏈上的復(fù)合體I/II的電子傳遞，以及具有清除線粒體內(nèi)ROS作用的超氧化物歧化酶2功能，同時(shí)ONOO-也能促使線粒體膜孔徑的變化，或者膜通透性轉(zhuǎn)換孔大小的改變，使鈣離子流發(fā)生改變[38]。另有研究表明，過(guò)量的NO能直接結(jié)合細(xì)胞色素氧化酶(cytochrome oxidase)而抑制線粒體呼吸鏈功能[3]。在心肌肥大病理模型中，線粒體促融合蛋白(mitofusin，Mfn2)表達(dá)水平下降。在缺乏Mfn2 的心肌細(xì)胞中表現(xiàn)出破碎的網(wǎng)狀線粒體和改變的嵴結(jié)構(gòu),而且降低了鈣依賴的線粒體通透性的改變，并且減弱了心肌細(xì)胞因缺血-再灌注損傷而引起的細(xì)胞鐵死亡[39]。而大鼠和小鼠中Mfn2的減少能導(dǎo)致VSMC的過(guò)度增殖，加速心肌肥大[40]。說(shuō)明NO代謝改變能引起線粒體變化從而誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡。在小鼠急性免疫性肝炎(acute immune hepatitis)模型中，肝細(xì)胞發(fā)生鐵死亡并伴隨大量RNS堆積。當(dāng)用鐵死亡抑制劑ferrostatin-1、iNOS抑制劑 (1400W) 或者ONOO-清除劑 (Fe-TMPyP)處理后，小鼠肝細(xì)胞中RNS和鐵死亡大量減少，表明NO代謝失調(diào)與鐵死亡關(guān)系密切[41, 42]。然而，值得注意的是，最近Homma等[43]在小鼠肝癌Hepa 1-6細(xì)胞中表明，NO能通過(guò)中止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)來(lái)保護(hù)細(xì)胞逃離鐵死亡。

CYGB具有一氧化氮雙加氧酶活性，能夠?qū)O轉(zhuǎn)換成NO3-[3]。雖然肌紅蛋白和血紅蛋白等珠蛋白都具有清除NO的作用，但有研究表明，在VSMC中，CYGB的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)肌紅蛋白(約45倍)和血紅蛋白(約200倍以上)，能調(diào)控VSMC中約70% ～ 75%的NO代謝[44]。因此，CYGB通過(guò)調(diào)控NO代謝影響血管張力和血壓，并通過(guò)減少ONOO-的產(chǎn)生保護(hù)細(xì)胞。事實(shí)上，在CYGB敲低的VSMC中及cygb-/-小鼠的血管中，NO代謝的速率顯著降低，且小鼠血管壁內(nèi)NO的濃度增加、血管舒張、血壓和血管阻力顯著降低[45, 46]。通過(guò)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模式大鼠注射重組人源的CYGB后能顯著提高SOD和GPX活性，降低血中低密度脂蛋白，提升高密度脂蛋白，改善動(dòng)脈粥樣硬化癥狀[47]。

綜合前面的研究發(fā)現(xiàn)，cygb-/-老年小鼠出現(xiàn)了心肌肥大，且對(duì)NO介導(dǎo)的血管舒張表現(xiàn)增強(qiáng)，平均動(dòng)脈血壓下降了30%，說(shuō)明CYGB在調(diào)控血管功能方面具有重要作用[26]。下調(diào)CYGB的表達(dá)可矯正由血管緊張素引起的高血壓[3]。盡管我們的研究顯示，CYGB過(guò)表達(dá)能促進(jìn)線粒體活性氧物質(zhì)和膜電位改變及促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡。但是，在病變狀態(tài)下的心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞處于一個(gè)什么樣的氧化還原狀態(tài)，同時(shí)CYGB蛋白活性狀態(tài)及如何調(diào)控細(xì)胞鐵死亡等這些問(wèn)題仍需進(jìn)一步明確。

5 胞紅蛋白與肝纖維化及細(xì)胞鐵死亡

肝纖維化是由HSC細(xì)胞激活，并大量增殖，表達(dá)炎癥因子及細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)基因，是導(dǎo)致肝硬化和肝癌的發(fā)生重要原因之一[48]。HSC激活與低氧條件緊密聯(lián)系，低氧誘導(dǎo)因子-1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)是低氧條件誘導(dǎo)下的重要因子，通過(guò)抑制線粒體三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化，促使HSC活化。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ROS和脂質(zhì)活性氧代謝產(chǎn)物增加[2]。近期的研究表明，肝纖維化與細(xì)胞鐵死亡密切相關(guān)。鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin及索拉菲尼能減輕小鼠肝的纖維化[49]。治療瘧疾的青蒿醚能促進(jìn)p53介導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡，進(jìn)而抑制HSC激活和肝纖維化[21]。四氯化碳是誘導(dǎo)小鼠肝纖維化的常用試劑，其處理小鼠同時(shí)用青蒿琥酯后，肝纖維化得到明顯抑制[50]。進(jìn)一步研究表明，青蒿琥酯能促進(jìn)激活的HSC內(nèi)鐵離子富集，脂質(zhì)活性氧上升，并降低抗氧化物質(zhì)例如GSH含量，而這一過(guò)程又能被鐵死亡抑制劑去鐵胺所逆轉(zhuǎn)。但是另外一個(gè)方面，高鐵食物喂養(yǎng)小鼠能夠在促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡的同時(shí)提升肝纖維化，但能被鐵死亡抑制劑ferrostatin-1逆轉(zhuǎn)。這一結(jié)果說(shuō)明，鐵死亡能促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展[51]。事實(shí)上在纖維化進(jìn)程中，激活的HSC出現(xiàn)脂質(zhì)過(guò)氧化代謝產(chǎn)物大量堆積，它們能被鐵死亡抑制劑，例如維生素E(vitamin E)、GSH、Mito-TEMPO等在一定程度上減緩。說(shuō)明調(diào)控細(xì)胞鐵死亡在纖維化進(jìn)程中具有重要影響。

雖然在HSC纖維化進(jìn)程中暫無(wú)報(bào)道表明CYGB對(duì)細(xì)胞鐵死亡的調(diào)控，但CYGB表達(dá)水平的變化嚴(yán)重影響HSC纖維化。CYGB是HSC激活后被大量表達(dá)的一種蛋白質(zhì)。cygb-/-小鼠用二乙基亞硝胺處理后，肝更早出現(xiàn)纖維化，炎癥增加，DNA斷裂，大量ONOO-堆積[52]。另一方面，在cygb過(guò)表達(dá)小鼠用硫代乙酰胺處理后，肝出現(xiàn)中性粒細(xì)胞聚集，炎癥因子大量表達(dá)和纖維化[53]。同樣，cygb-/-的HSC則出現(xiàn)激活型HSC的特征，具有顯著上升的ROS，炎癥因子的表達(dá)[25]。更有報(bào)道顯示，在丙型肝炎病毒感染引起人肝纖維化的不同階段，隨著纖維化進(jìn)程的加劇，CYGB陽(yáng)性的細(xì)胞逐漸的減少[54]。而對(duì)CYGB末端組氨酸His81突變后, 對(duì)膠原合成及自由基誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞的活化的抑制效果減弱，說(shuō)明CYGB可以作為調(diào)控纖維化的一個(gè)重要靶點(diǎn)[55]。

不可忽視的是在HSC激活的過(guò)程中，CYGB表達(dá)被激活，而CYGB基因上游存在HIF-1α結(jié)合位點(diǎn)能受到低氧脅迫誘導(dǎo)而表達(dá)，那么CYGB是否介導(dǎo)HIF-1α對(duì)線粒體的調(diào)控，是否參與細(xì)胞鐵死亡仍需進(jìn)一步明確。另一方面，本課題組的研究表明，CYGB在癌細(xì)胞中能調(diào)控p53介導(dǎo)的細(xì)胞鐵死亡，那么在HSC激活過(guò)程中，闡明CYGB對(duì)細(xì)胞鐵死亡的調(diào)控機(jī)制將值得關(guān)注。

6 問(wèn)題與展望

自CYGB發(fā)現(xiàn)迄今20年，對(duì)其功能的探索一直在持續(xù)。首先，作為珠蛋白家族中的一員，CYGB不僅具有攜帶和運(yùn)輸氧氣的能力，還具有清除活性氧物質(zhì)和調(diào)控NO代謝的作用。CYGB氨基酸序列內(nèi)含有2個(gè)半胱氨酸，受細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)影響，可在分子內(nèi)或者2個(gè)分子之間形成S-S鍵，改變CYGB與O2或者其他信號(hào)分子的結(jié)合，從而引起下游通路改變。但目前與CYGB結(jié)合的具體信號(hào)分子仍不十分明確，尤其是在一些低氧環(huán)境及病理狀態(tài)下的下游信號(hào)通路仍需進(jìn)一步明確；其次，盡管我們的研究表明，CYGB過(guò)表達(dá)后線粒體功能受損，且CYGB具有與線粒體膜結(jié)合的特性，但這種結(jié)合是否具有生物學(xué)意義，是否能影響線粒體對(duì)鐵死亡的調(diào)控，目前仍不得而知。鑒于線粒體在調(diào)控鐵死亡方面的重要作用，探尋CYGB通過(guò)何種具體方式影響線粒體功能，將會(huì)極大推動(dòng)對(duì)CYGB功能的了解；最后，前面研究表明，HSC與中性粒細(xì)胞共培養(yǎng)條件下可激活其產(chǎn)生更多的ROS，且在cygb敲除后的HSC中發(fā)現(xiàn)了更高表達(dá)的炎癥因子和趨化因子。由于炎癥與纖維化、血管病變及癌癥發(fā)生密切相關(guān)，那么CYGB如何影響免疫細(xì)胞，通過(guò)何種信號(hào)通路及作用機(jī)制調(diào)控炎癥反應(yīng)，鐵死亡的調(diào)控平衡是否會(huì)是一個(gè)重要的節(jié)點(diǎn)，對(duì)這些問(wèn)題的闡明將非常值得期待。

綜上所述，本文闡明了近年來(lái)CYGB在調(diào)控纖維化、心血管疾病及癌癥方面的研究進(jìn)展，且將其與細(xì)胞鐵死亡關(guān)聯(lián)起來(lái)，并推測(cè)CYGB在細(xì)胞鐵死亡調(diào)控方面具有不可忽視的重要功能(Fig.1)。因此，闡明CYGB在調(diào)控細(xì)胞鐵死亡方面的機(jī)制和作用方式，將有助于進(jìn)一步明確CYGB的功能，并對(duì)日益增長(zhǎng)和加速的心血管疾病及癌癥發(fā)生提供有價(jià)值的基礎(chǔ)研究。