孔梓宇， 柳 毅， 汪 暉,2)*

(1)武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系， 武漢 430071； 2)湖北省疾病發(fā)展與防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430071)

基于Cre-loxP系統(tǒng)的基因敲除具有操作簡單、傳代相對(duì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)際應(yīng)用Cre-loxP系統(tǒng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其存在缺陷，例如Cre重組酶的毒性、Cre重組酶的“異位”表達(dá)等。為了解決這些問題，人們改進(jìn)設(shè)計(jì)方案，并不斷優(yōu)化Cre-loxP系統(tǒng)，使其能夠更好地適用于各種條件下的敲除目的。本文從Cre序列的構(gòu)建、flox序列的構(gòu)建以及條件性敲除(conditional knockout, CKO)動(dòng)物的繁育等方面綜述了這些實(shí)際應(yīng)用方案，并總結(jié)了一些能夠更好地控制敲除時(shí)間空間特異性的衍生Cre-loxP系統(tǒng)，包括不依賴他莫西芬的可誘導(dǎo)Cre重組酶、高活性Cre重組酶以及光信號(hào)介導(dǎo)的Cre重組酶等[1-3]。最后，本文展望了未來Cre-loxP系統(tǒng)的發(fā)展前景，對(duì)Cre-loxP系統(tǒng)的進(jìn)一步成熟、可控性的提升提供新思路。

1 Cre-loxP系統(tǒng)

Cre-loxP系統(tǒng)起源于P1噬菌體。Cre重組酶是一類由343個(gè)氨基酸構(gòu)成的重組酶，于1981年在P1噬菌體中被發(fā)現(xiàn)，屬于λ Int酶超基因家族，能夠特異性識(shí)別loxP位點(diǎn)，并發(fā)揮重組酶活性或限制酶活性[4]。當(dāng)目標(biāo)基因序列的兩側(cè)嵌入同向的loxP位點(diǎn)時(shí)，Cre重組酶會(huì)特異性識(shí)別loxP位點(diǎn)并使其成環(huán)斷開，實(shí)質(zhì)上造成了loxP位點(diǎn)之間的基因被敲除[5]。loxP位點(diǎn)同樣來源于P1噬菌體，長度為34 bp，包括了2個(gè)回文序列和中間8 bp的核心序列。回文序列是Cre重組酶的特異識(shí)別位點(diǎn)，而核心序列則決定了loxP位點(diǎn)的方向性[6]。

Cre重組酶特異性識(shí)別回文序列并結(jié)合形成二聚體，此后2條染色體上同時(shí)形成二聚體并再次結(jié)合形成四聚體。此時(shí)2個(gè)loxP位點(diǎn)間的DNA序列會(huì)被Cre重組酶切斷。緊接著，DNA連接酶會(huì)快速高效地將這些序列連接起來。根據(jù)loxP位點(diǎn)的位置和方向[7]，重組結(jié)果可分為以下3種情況：如果2個(gè)loxP位點(diǎn)位于同一條DNA鏈上且方向相同，Cre重組酶介導(dǎo)loxP間的序列切除；如果2個(gè)loxP位點(diǎn)位于同一條DNA鏈上且方向相反，Cre重組酶介導(dǎo)loxP間的序列反轉(zhuǎn)；如果2個(gè)loxP位點(diǎn)位于不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶介導(dǎo)DNA鏈發(fā)生交換或染色體易位[8]。

自80年代起，基因敲除逐漸發(fā)展，世界已涌現(xiàn)出各種基因編輯的技術(shù)。例如，鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases，ZFN)技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)技術(shù)等。但這些技術(shù)操作工序繁瑣，且不具有組織特異性。而全身性敲除極有可能導(dǎo)致胚胎的致死率過高，同時(shí)難以研究某一器官或組織中某一基因的功能。因此，選用基于Cre-loxP系統(tǒng)的基因敲除，可以通過組織特異性啟動(dòng)子與該系統(tǒng)的聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)組織特異性基因敲除，這大大拓寬了基因敲除的空間可塑性與應(yīng)用前景。

2 Cre-loxP的實(shí)際應(yīng)用

雖然Cre-loxP系統(tǒng)的橫空出世實(shí)現(xiàn)了基因編輯技術(shù)的又一次飛躍，然而在實(shí)際應(yīng)用Cre-loxP系統(tǒng)時(shí)，仍然發(fā)現(xiàn)其存在潛在的缺陷[9]。以小鼠為例，規(guī)避這些問題需要從Cre工具鼠的構(gòu)建、flox工具鼠的構(gòu)建以及條件性敲除繁育等方面逐一考慮。

2.1 序列的插入策略

在進(jìn)行工具鼠構(gòu)建時(shí)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)常被應(yīng)用于靶序列插入環(huán)節(jié)。載體構(gòu)建完成后，經(jīng)尾靜脈注射或胚胎干細(xì)胞注射技術(shù)可以構(gòu)建Cre工具鼠或flox工具鼠。在實(shí)際應(yīng)用過程中，靶序列的長度、位置、插入方式等特性都需要根據(jù)要求進(jìn)行個(gè)性化設(shè)計(jì)，以避免無效插入。

2.1.1 CRISPR系統(tǒng)在插入序列中的應(yīng)用 目前，常用CRISPR/Cas9系統(tǒng)將所需的序列插入表達(dá)載體中。CRISPR/Cas9系統(tǒng)起源于細(xì)菌，是細(xì)菌在長期進(jìn)化中逐漸形成的免疫防御系統(tǒng)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)包含一種被稱為sgRNA的單向?qū)NA，由靶標(biāo)特異的crRNA和通用的tracrRNA組成。tracrRNA招募的Cas9核酸酶可以識(shí)別靶基因PAM序列，并在其上游3～4bp位置進(jìn)行剪切而形成雙鏈斷裂。斷裂的DNA若采用非同源末端連接的方式進(jìn)行修復(fù)，則可實(shí)現(xiàn)基因敲除；反之，若采用同源重組的方式進(jìn)行修復(fù)，則可實(shí)現(xiàn)基因敲入[10]。人們對(duì)受精卵進(jìn)行特殊處理可以使細(xì)胞傾向于采用同源重組的方式進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)Cre編碼基因的插入。相比于其他的基因編輯技術(shù)，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的序列插入具有較大的優(yōu)勢，這主要因?yàn)镃RISPR/Cas9技術(shù)問世前的定向打靶都依賴于DNA序列特異性結(jié)合蛋白質(zhì)模塊的合成，這一步驟非常繁瑣費(fèi)時(shí)；而CRISPR/Cas9技術(shù)使用一段序列特異性向?qū)NA分子引導(dǎo)核酸內(nèi)切酶到靶點(diǎn)處，顯著縮減了前期設(shè)計(jì)成本。同時(shí)，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基因編輯是較為可靠的，脫靶概率較低[11]。因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)被認(rèn)為是十分便捷且高效的動(dòng)物模型構(gòu)建工具[11]，對(duì)小鼠基因組工程的實(shí)施產(chǎn)生了重大影響[12,13]。

2.1.2 Cre的插入策略 Cre編碼序列的插入位置一般有2種：原位插入和安全位點(diǎn)插入。原位插入是指根據(jù)敲除目的合理選擇上游的啟動(dòng)子序列，然后將Cre編碼序列插入至靶基因附近的插入方法。在實(shí)際操作中，若需進(jìn)行全身敲除，則可在Cre編碼序列前連接管家基因以保證全身性的Cre酶表達(dá)；有時(shí)需要針對(duì)某基因進(jìn)行組織特異性敲除，此時(shí)要在Cre編碼序列前連接組織特異性表達(dá)基因，以保證Cre序列與靶基因共用啟動(dòng)子區(qū)域。第2種插入方法為安全位點(diǎn)插入。早在20 世紀(jì) 90 年代人們就發(fā)現(xiàn)，ROSAβgeo26的隨機(jī)轉(zhuǎn)基因小鼠品系在所有組織中都能檢測到高水平的β半乳糖苷酶表達(dá)。由于Rosa26位點(diǎn)能保證外源基因的正常穩(wěn)定表達(dá)，因此，人們稱其為安全位點(diǎn)[14]。在此，本文給出了一種典型的Rosa26基因敲入的載體設(shè)計(jì)圖(Fig.1)。此后，又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了許多安全位點(diǎn)，例如H11、CCR5、AAVS1等位點(diǎn)[15, 16]。其中，H11位點(diǎn)位于小鼠第11號(hào)染色體的Eif4enif1與Drg1基因之間[17]，且這2個(gè)基因的側(cè)翼序列能夠使整合在此的外源基因受指定啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)而穩(wěn)定表達(dá)。并且H11位點(diǎn)的純合插入小鼠也能實(shí)現(xiàn)正常的發(fā)育與繁殖，這使得H11成為了繼Rosa26之后最受歡迎的安全位點(diǎn)。

Fig.1 A typical ROSA26 knock-in vector design The combined exogenous sequence is integrated into the ROSA26 safety site through homologous recombination. When the recombinant enzyme Cre comes into play, the stop sequence will be cut off, thus driving the expression of the target sequence

安全位點(diǎn)除了可驅(qū)動(dòng)靶基因的穩(wěn)定表達(dá)以外，還能用來規(guī)避cre重組酶與loxP位點(diǎn)位于同一染色體上的問題。當(dāng)Cre編碼序列與loxP序列位于同一染色體的時(shí)候，除非發(fā)生預(yù)期外的重組，否則后續(xù)的繁育無法正常獲得符合條件的動(dòng)物(Fig.2)。此時(shí)，采用在安全位點(diǎn)進(jìn)行基因敲入的方式，可將Cre序列轉(zhuǎn)移至非連鎖基因座上，從而避免了上述情況。因此，安全位點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)有效解決了Cre與loxP連鎖遺傳的問題。

Fig.2 Genetic representation when Cre and LoxP on the same chromosome When the Cre encoding sequence and loxP sequence are located on the same chromosome, we can never obtain mice containing both Cre and allelic loxP sequences unless an unexpected recombination occurs

在真核生物中，絕大多數(shù)基因都存在多個(gè)外顯子與內(nèi)含子，如何選擇合適的位置插入Cre編碼序列取決于后續(xù)研究的需要。通常來說，Cre重組酶插入在基因第1個(gè)外顯子前可以保證Cre重組酶的表達(dá)量，但可能會(huì)影響下游基因的正常表達(dá)；而將Cre編碼序列插入在基因的最后1個(gè)外顯子下游，則會(huì)起到對(duì)原基因的保護(hù)作用，卻又可能導(dǎo)致Cre重組酶的表達(dá)量降低。由于現(xiàn)在人類尚未研究清楚每一個(gè)具體的插入位點(diǎn)會(huì)帶來什么樣的分子生物學(xué)影響，因此在無法查詢到相關(guān)信息的時(shí)候，一般根據(jù)自身的需要以及前人的經(jīng)驗(yàn)來選擇Cre重組酶的插入位點(diǎn)。此外，Cre編碼序列盡量不要跨過內(nèi)含子區(qū)域，以防止對(duì)序列的表達(dá)產(chǎn)生不可預(yù)知的影響。

Fig.3 A schematic diagram of a typical TdTomato sequence insert scheme The STOP sequence expressing Cre enzyme was cleaved and the red fluorescent protein was expressed. By observing the red fluorescence of animals, it can be determined whether there is leakage expression

2.1.3 loxP的插入策略 基于Cre-loxP系統(tǒng)的基因敲除需要在感興趣的基因上下游插入2個(gè)同向的loxP序列。然而，實(shí)際操作過程中可能會(huì)遇到基因敲除致死的情況發(fā)生，此時(shí)應(yīng)適當(dāng)減小loxP位點(diǎn)間的距離。例如，對(duì)NR3C1進(jìn)行組織特異性敲除的時(shí)候，一般僅在單一外顯子的兩側(cè)插入loxP位點(diǎn)[18]。在這種情況下，外顯子的選擇可根據(jù)自身研究的需要進(jìn)行調(diào)整。當(dāng)loxP位點(diǎn)下游有多個(gè)外顯子時(shí)，應(yīng)考慮Cre酶介導(dǎo)的同源重組是否會(huì)帶來移碼突變，此時(shí)為了降低致死率，應(yīng)盡可能避免移碼突變的發(fā)生。

2.2 序列的驗(yàn)證試驗(yàn)

在設(shè)計(jì)Cre表達(dá)載體的時(shí)候，需要設(shè)計(jì)1個(gè)或多個(gè)表達(dá)標(biāo)簽蛋白質(zhì)的序列來進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。常用的標(biāo)簽蛋白質(zhì)有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)等。這些蛋白質(zhì)的編碼序列需要與Cre序列嵌合插入并共同表達(dá)，才能滿足后續(xù)驗(yàn)證的需要。在設(shè)計(jì)標(biāo)簽蛋白的插入位置時(shí)，若插入的蛋白質(zhì)是含有信號(hào)肽的蛋白質(zhì)，則盡量在C-端插入而避開N-端。因?yàn)镹-端的標(biāo)簽會(huì)跟隨信號(hào)肽一同被剪切，從而喪失驗(yàn)證的功能。

Cre重組酶通常靶向成年小鼠中少量細(xì)胞中表達(dá)的基因。然而，在生殖系或發(fā)育早期可能存在Cre重組酶的短暫表達(dá)[19]。這種非正常現(xiàn)象被稱為“異位”，其發(fā)生概率較高，并且少量Cre重組酶作用于loxP位點(diǎn)便可以激發(fā)。當(dāng)Cre重組酶存在于男性生殖系中時(shí)，可能會(huì)有少量的Cre重組酶通過精子傳遞到發(fā)生重組的卵子中。當(dāng)Cre重組酶在卵母細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，即使在受精后也能發(fā)生重組[20]。通過與熒光標(biāo)記flox動(dòng)物交配可以對(duì)Cre重組酶的表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。相比較而言，這種驗(yàn)證能更精確地獲取Cre酶的空間特異性表達(dá)情況[21]。例如，在TdTomato熒光蛋白上游添加loxP-STOP-loxP序列，并利用CAG啟動(dòng)子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，可將整個(gè)片段插入在Rosa26位點(diǎn)上(Fig.3)。在Cre重組酶表達(dá)前，STOP序列的存在阻止了紅色熒光蛋白質(zhì)的表達(dá)，而與含有組織特異性Cre酶進(jìn)行交配繁育后，其子代同時(shí)具有Cre重組酶與loxP位點(diǎn)，表達(dá)Cre酶的細(xì)胞內(nèi)STOP序列被剪切，紅色熒光蛋白質(zhì)得以表達(dá)。而通過觀察F1代動(dòng)物的紅色熒光，可以確定所構(gòu)建的Cre工具動(dòng)物是否存在泄漏表達(dá)的情況[22]。

在設(shè)計(jì)針對(duì)flox動(dòng)物的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，常用的是在mRNA水平上進(jìn)行驗(yàn)證。針對(duì)flox工具鼠，研究通常在靶標(biāo)序列兩側(cè)的loxP位點(diǎn)外設(shè)計(jì)2個(gè)引物[23]。在驗(yàn)證時(shí)，選取小鼠尾部部分組織進(jìn)行DNA提取，隨后逆轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的攜帶或不攜帶loxP標(biāo)簽的靶序列，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(Fig.4)。由于所攜帶的loxP標(biāo)簽的序列長度大于未攜帶的loxP標(biāo)簽序列，因此，在凝膠中泳動(dòng)距離較短的條帶為flox序列，反之為陰性序列。

在針對(duì)CKO敲除鼠進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)，同樣可以在loxP位點(diǎn)外側(cè)設(shè)計(jì)2個(gè)引物。但實(shí)際操作過程中，敲除的片段經(jīng)常過大而導(dǎo)致其無法被正常擴(kuò)增，此時(shí)也可以選擇在loxP位點(diǎn)內(nèi)部再額外設(shè)計(jì)一個(gè)引物[24, 25](Fig.5)。

Fig.4 Verification design of flox tool mouse Two primers were designed outside the loxP sites on both sides of the target sequence, and the genotypes of the animal could be determined according to the size of the bands in agar-gel electrophoresis. Two strips mean homozygous; A short band and a long band mean heterozygous; Two bands mean negative

除了上述基于mRNA水平上的驗(yàn)證，還可以進(jìn)行蛋白質(zhì)水平上的驗(yàn)證。常用方法為設(shè)計(jì)相應(yīng)的抗體，進(jìn)行Western印跡、免疫組化以及免疫熒光等實(shí)驗(yàn)。

2.3 條件性敲除繁育

在獲得符合條件的Cre工具鼠與flox工具鼠后，需要將兩種工具鼠進(jìn)行交配繁育，以獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。常規(guī)的交配方式，一般采用flox純合小鼠與Cre雜合小鼠進(jìn)行交配，其后代會(huì)產(chǎn)生半數(shù)flox(+/-)cre(+/-)與半數(shù)flox(+/-)cre(-/-)小鼠[26]。一般在利用Cre-loxP系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除時(shí)，不需要Cre處于純合狀態(tài)。這是由于Cre的雜合狀態(tài)已經(jīng)足以表達(dá)一定量的Cre重組酶，并且Cre的純合可能會(huì)導(dǎo)致其等基因座的序列被徹底破壞，從而產(chǎn)生不可預(yù)知的結(jié)果[27]。此外，研究表明，Cre重組酶在發(fā)育精子中的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致雄性不育，這可能是Cre介導(dǎo)的基因組重排所致[28]。

在利用Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建組織特異性或者細(xì)胞特異性基因敲除的時(shí)候，需要考慮到Cre泄漏表達(dá)的問題[29]。例如，研究顯示，Tg(Thy1-cre)1Vln(Thy1-cre)原本被認(rèn)為僅在大腦皮質(zhì)與海馬神經(jīng)元內(nèi)表達(dá)[30]。但后來發(fā)現(xiàn)，心肌、血管內(nèi)皮、肺泡和細(xì)支氣管細(xì)胞、皮膚以及睪丸等器官中均有cre表達(dá)[8]。值得注意的是，一些生殖細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre或一些在生殖細(xì)胞中“異位”表達(dá)的Cre，會(huì)導(dǎo)致其子代的靶序列全身性敲除，破壞了原有的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚31]。此時(shí)，可以采用單性別繁育，即僅利用某單一性別小鼠作為Cre工具鼠[20]。

3 Cre-loxP系統(tǒng)在條件性基因敲除中的優(yōu)化應(yīng)用

Cre-loxP重組系統(tǒng)目前已廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究。然而，最初無法對(duì)這種重組進(jìn)行高精度時(shí)空控制[3]。為此，研究嘗試開發(fā)新型Cre-loxP系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)對(duì)基因編輯的時(shí)空特異性。

3.1 時(shí)間可誘導(dǎo)型Cre

重組酶Cre的表達(dá)可以在空間上由組織特異性啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控，而在時(shí)間上會(huì)由外源誘導(dǎo)物調(diào)控。他莫昔芬系統(tǒng)和四環(huán)素系統(tǒng)是目前常用的兩套在時(shí)間上控制Cre重組酶表達(dá)的系統(tǒng)。此外，光等物理因素也能作為誘導(dǎo)信號(hào)對(duì)Cre的表達(dá)狀態(tài)進(jìn)行控制。

3.1.1 配體誘導(dǎo)型Cre 最初的研究發(fā)現(xiàn)，將Cre與人類雌激素受體(estrogen receptor, ER)的配體結(jié)合區(qū)結(jié)合形成的復(fù)合體，只有在雌激素誘導(dǎo)后才會(huì)與錨定蛋白質(zhì)HSP90脫離，從而入核發(fā)揮作用。為了避免內(nèi)源雌激素的干擾，在雌激素受體ER的配體結(jié)合區(qū)(ligand binding domain, LBD)做一個(gè)點(diǎn)突變(G521R)就可以使Cre-ER只響應(yīng)外源的人工合成雌激素的誘導(dǎo)，命名為Cre-ERT。Cre-ERT的出現(xiàn)使研究胚胎致死基因在發(fā)育后期的功能得以實(shí)現(xiàn)，并且可以利用這種小鼠系進(jìn)行譜系示蹤[32]。而另一種LBD 突變體融合蛋白質(zhì)被證明，其對(duì)4-OHT具有遠(yuǎn)高于Cre-ERT的敏感性，這種突變體是Cre-ERT2，它帶有人ER LBD中的3個(gè)點(diǎn)突變：C400V/M453A/L544A。目前，新研發(fā)的Cre-ERT2比Cre-ERT效率更高[33]。但即使是優(yōu)化后的Cre-ERT2系統(tǒng)，也不乏其泄露表達(dá)的報(bào)道[34, 35]。事實(shí)上，Cre-ERT2的泄漏表達(dá)是隨機(jī)發(fā)生的，但其發(fā)生概率與Cre-ERT2分子豐度、染色質(zhì)狀態(tài)甚至loxP的物理定位都有關(guān)系[32]。因此，在設(shè)計(jì)譜系追蹤和脈搏追蹤實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)該考慮到與他莫西芬無關(guān)的Cre-ERT2活性的影響。為了降低這種背景影響，可以使用重組閾值相對(duì)較高的報(bào)告基因，例如mTmG或R26R-EYFP等[36]。

3.1.2 啟動(dòng)子激活型Cre 與配體誘導(dǎo)型Cre不同，啟動(dòng)子激活型Cre通過驅(qū)動(dòng)Cre重組酶的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)來操縱基因敲除。例如，四環(huán)素系統(tǒng)是基于四環(huán)素操縱子的系統(tǒng)。由于四環(huán)素阻遏蛋白質(zhì)(tetracycline repressor protein, tetR) 與四環(huán)素操縱子序列(tetracycline operator DNA sequence, tetO)的自然結(jié)合狀態(tài)可以阻止四環(huán)素抗性基因表達(dá)，Tet的存在能終止tetR和tetO的結(jié)合狀態(tài)，從而解除四環(huán)素操縱子的阻遏作用[37]。后來，根據(jù)此原理開發(fā)了Tet-on系統(tǒng)與Tet-off系統(tǒng)等基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)。在Tet-on系統(tǒng)中，不給予Tet時(shí)目的基因處于表達(dá)狀態(tài)，而在Tet-off系統(tǒng)中，給予Tet時(shí)目的基因處于表達(dá)狀態(tài)[38-40]。與Cre-ERT類似的是，此類時(shí)間誘導(dǎo)型Cre-loxP系統(tǒng)能規(guī)避大量Cre酶帶來的細(xì)胞毒性，但對(duì)于增殖速度極快的細(xì)胞仍然具有較強(qiáng)毒性。因此，在解釋快速增殖的細(xì)胞相關(guān)研究時(shí)，要謹(jǐn)慎對(duì)待Cre-loxP系統(tǒng)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[41]。

同時(shí)，干擾素系統(tǒng)也是啟動(dòng)子激活型Cre的重要組成部分。通過干擾素，例如pIpC等可以誘導(dǎo)Mx1基因啟動(dòng)子的激活，從而驅(qū)動(dòng)Cre重組酶的表達(dá)。然而，干擾素系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)的Cre模塊容易自發(fā)重組，并且pIpC本身便會(huì)引起不良的副作用。因此，在血液學(xué)研究等領(lǐng)域中，對(duì)Mx1-Cre系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)的基因敲除需要進(jìn)行穩(wěn)態(tài)控制。例如，開發(fā)新誘導(dǎo)物、移植誘導(dǎo)等方法[42]。

3.1.3 光誘導(dǎo)型Cre 與化學(xué)誘導(dǎo)劑可能具有細(xì)胞毒性、泄露表達(dá)的缺陷相比，光是一種很好的時(shí)空調(diào)控基因表達(dá)的誘導(dǎo)劑。然而，并非所有波段的光都適合作為誘導(dǎo)劑。藍(lán)光的光誘導(dǎo)型Cre酶，例如CRY2-Cre系統(tǒng)中，2個(gè)Cre片段融合到對(duì)藍(lán)光敏感的植物光受體隱花色素2 (cryptochrome 2, CRY2)或其結(jié)合域CIB1上。其中，一種組分與CRY2融合，另一種組分與CIB1融合，被藍(lán)光照射會(huì)引起異二聚化[3]。但這種藍(lán)光進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，由于其組織穿透性不強(qiáng)，因此，需要較長時(shí)間進(jìn)行誘導(dǎo)?？紤]到藍(lán)光等短波長光源對(duì)細(xì)胞的光毒性，此類光誘導(dǎo)型Cre酶的引用因此受到了局限；同樣，常規(guī)的基于紫外光誘導(dǎo)的光誘導(dǎo)型Cre存在較強(qiáng)的光毒性，可能給細(xì)胞帶來影響[43]。

研究表明，較長的波長光源一般具有更好的誘導(dǎo)能力。例如，遠(yuǎn)紅外光源相比于常規(guī)光源的組織穿透性更強(qiáng)[1]。因此，利用長波長光作為誘導(dǎo)光源能顯著縮短誘導(dǎo)時(shí)間，可能會(huì)大幅度降低對(duì)細(xì)胞的光毒性。在一種遠(yuǎn)紅光誘導(dǎo)的Cre-loxP系統(tǒng)中，Cre重組酶分為2個(gè)片段，N-端Cre片段融合到Coh2結(jié)構(gòu)域，而C-端Cre片段融合到DocS區(qū)域。該融合蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)由frl反應(yīng)啟動(dòng)子PFRLx驅(qū)動(dòng)。在FRL光照下，2個(gè)片段結(jié)合在一起時(shí)，可以根據(jù)Coh2和DocS域的強(qiáng)親和力，重新構(gòu)建Cre重組酶的活性[44]。該系統(tǒng)對(duì)小鼠無明顯的細(xì)胞毒性作用，重組效率也有了大幅度提升。

總之，將Cre-loxP系統(tǒng)與相關(guān)其他分子生物學(xué)工具聯(lián)用可以獲得其時(shí)間空間可控性，從而滿足各種條件的敲除需要。

3.2 活性改造型Cre

對(duì)Cre元件的改造顯著提升了Cre重組酶的活性。例如，通過在Cre元件上引入真核細(xì)胞核定位序列NLS，此時(shí)的Cre重組酶能在低表達(dá)豐度下實(shí)現(xiàn)重組。這對(duì)于一些低豐度的啟動(dòng)子十分重要。此外，有研究提及了sCreER系統(tǒng)，該系統(tǒng)具備轉(zhuǎn)換成其他活性形式Cre的能力，從而顯著提升DNA重組效率[45]。在R26-LZLT、R26-GFP或Kdr等位基因等重組相對(duì)惰性的基因位點(diǎn)上，sCreER都能有效介導(dǎo)基因重組。憑借這一獨(dú)特的優(yōu)勢，sCreER將進(jìn)一步推動(dòng)生物醫(yī)學(xué)研究。例如，通過R26-tdTomato報(bào)告基因發(fā)現(xiàn)，Npr3-sCreER和Col1a2-sCreER分別有效靶向大多數(shù)心內(nèi)膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞[44]。同時(shí)，sCreER經(jīng)過一次他莫西芬誘導(dǎo)后，可以轉(zhuǎn)換成Cre，這將顯著降低他莫昔芬本身帶來的毒性，從而避免動(dòng)物表型受其干擾。

4 問題與展望

總之，基于Cre-loxP系統(tǒng)的基因敲除是基因編輯發(fā)展史上重要的里程碑。它顯著縮減了基因敲除的繁雜步驟，也更加適用于對(duì)特定組織或細(xì)胞種類進(jìn)行特異性基因敲除，明顯拓寬了基因敲除的應(yīng)用范疇。同時(shí)，這種基因敲除技術(shù)在實(shí)際操作方面存在大量需要考慮的問題。例如，Cre重組酶的泄漏表達(dá)、序列插入時(shí)的脫靶現(xiàn)象、非預(yù)料的重組與敲除效率不穩(wěn)定等。人們通過不斷優(yōu)化Cre-loxP系統(tǒng)本身及其具體設(shè)計(jì)策略，不僅改善了上述情況，還實(shí)現(xiàn)了Cre-loxP系統(tǒng)的時(shí)間空間可控性?？梢灶A(yù)見的是，未來基于Cre-loxP系統(tǒng)的基因敲除會(huì)傾向于優(yōu)化Cre重組酶的特異性表達(dá)、優(yōu)化Cre重組酶的重組效率、提高重組精準(zhǔn)性與規(guī)避Cre重組酶的毒性。此外，還會(huì)嘗試將Cre-loxP系統(tǒng)的應(yīng)用范圍擴(kuò)大，以適應(yīng)更多的研究需要。例如，有研究指出，Cre-loxP系統(tǒng)與類似的Dre-rox系統(tǒng)聯(lián)用，會(huì)更精確地調(diào)控重組酶的表達(dá)，提高細(xì)胞譜系示蹤的精確性[46]?？偠灾?，在不久的將來，位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)將廣泛應(yīng)用于對(duì)基因操作的高分辨率時(shí)空控制有極大需求的生命科學(xué)研究領(lǐng)域[47]。