張苗，何德嬌，凌娜，李小麗，梁軼嵐，張麗麗，胡威

腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)簡稱腎癌，是常見的惡性腫瘤[1]。RCC對化療和放療的敏感性低，僅有少數(shù)患者可通過免疫治療獲效[2]。RCC患者5年生存率相對較低，尤其是RCC伴轉(zhuǎn)移患者5年生存率不超過10%[3]。FK506結(jié)合蛋白(FK506-binding proteins，F(xiàn)KBPs)在多種腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，參與調(diào)控癌細胞增殖、侵襲及遷移等[4-6]。FK506結(jié)合蛋白11(FK506-binding protein 11，F(xiàn)KBP11)的基因表達水平與RCC患者的預后密切相關，可作為潛在標志物評估RCC患者的預后[7]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)/Smad同源物3(mothers against decapentaplegic homolog 3, Smad3)信號通路參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等過程[8-9]。本研究通過觀察下調(diào)FKBP11對RCC細胞增殖、侵襲和遷移及TGF-β1/Smad3通路的影響，探討其在RCC中可能的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)細胞：人正常腎小管上皮細胞系HK-2和RCC細胞系A498、ACHN、CaKi-1、786-O均購自美國ATCC細胞庫。(2)試藥、劑試：DEME培養(yǎng)基、胰蛋白酶及CCK-8試劑盒均購自美國BPB公司；Lipofectamine 2000試劑盒購自美國Invitrogeng公司；Trizol試劑、qRT-PCR反應試劑盒、LY364947(TGF-β1/Smads通路抑制劑)、ECL發(fā)光試劑及結(jié)晶紫均購自美國Sigma公司；FKBP11 siRNA(si-FKBP11)和其陰性對照siRNA購自廣州Ruibo公司；Transwell小室購自美國Corning公司；一抗兔抗人FKBP11、增殖細胞核抗原(PCNA)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、凋亡抑制蛋白(Twist)、鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Snail)、TGF-β1、β-actin、Smad3及磷酸化Smad3(p-Smad3)均購自英國Abcam公司；所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。(3)儀器、設備：MG80型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱購于上海冠森生物科技有限公司；MultiskanTMFC型酶標儀、Applied Biosystems型qRT-PCR儀、NERLTM型流式細胞儀及E-Gel Imager型凝膠成像儀均購自美國Themo Fisher Scientific公司，TS100型倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.2 實驗方法 2020年3月—2021年3月于武漢大學人民醫(yī)院生物實驗室進行實驗。

1.2.1 細胞培養(yǎng)：人正常腎小管上皮細胞系(HK-2)和RCC細胞系(A498、ACHN、CaKi-1、786-O)培養(yǎng)于DEME培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中，在含5% CO2、飽和濕度的37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞生長狀態(tài)，細胞融合程度超過80%以上時，更換培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。用于檢測FKBP11的mRNA和蛋白表達水平。

1.2.2 細胞分組與轉(zhuǎn)染：取對數(shù)期且生長狀態(tài)良好的786-O細胞，以2×105個/ml的細胞密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，當細胞融合達到80%時，將細胞分為4組，正常培養(yǎng)細胞作為空白組，其余3組按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書分別轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA、si-FKBP11及si-FKBP11+LY364947 3 μl[9]，依次作為對照組、si-FKBP11組和si-FKBP11+LY364947組，轉(zhuǎn)染24 h后檢測各組細胞中FKBP11 mRNA和蛋白表達水平。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 不同細胞系中FKBP11的mRNA表達水平檢測：收集HK-2和RCC細胞，加入Trizol裂解液裂解細胞，提取細胞的總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，通過熒光定量PCR測定FKBP11的mRNA表達水平。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)反應程序為：95℃ 30 s，95℃ 5 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個循環(huán)。FKBP11引物：上游5’-GGCGTAGGCGATTGGTTCCTA-3’，下游5’-CCATTCCATTCAT-TTCTCTGGATCG-3’。GAPDH(內(nèi)參)引物：上游5’-CCCATGGCAAGTTCAAAGGCA-3’，下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTAGATT-3’。以2-△△CT計算細胞中FKBP11的mRNA相對表達量。

1.3.2 免疫印記(Western-blot)檢測細胞中蛋白表達水平：蛋白裂解液從細胞中提取總蛋白。取蛋白樣品使用SDS-PAGE膠電泳分離100 min，通過濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，隨后添加5%脫脂牛奶在室溫下封閉2 h，隨后加入一抗：FKBP11、PCNA、E-cadherin、Vimentin、Twist、Snail、TGF-β1、Smad3、p-Smad3和β-actin低溫過夜孵育，添加二抗孵育2 h，添加ECL化學發(fā)光混合液反應5 min，在凝膠成像儀中觀察拍照。使用Image J軟件分析條帶灰度值。蛋白相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin蛋白的灰度值。

1.3.3 786-O細胞增殖檢測：CCK-8法檢測細胞增殖活力。取各組處于對數(shù)期生長的786-O細胞，以細胞密度為5×103個/ml接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24、48、72 h時，每孔依次添加CCK-8溶液10 μl，再繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，使用酶標儀在450 nm波長下檢測各孔的光密度值(IOD)，以光密度值來表示細胞的增殖活力。

集落形成實驗檢測各組細胞集落形成情況，各組處理后的786-O細胞1×103個接種在6孔板中孵育2周。4%多聚甲醛固定細胞后通過1%結(jié)晶紫染色，通過顯微鏡拍照集落形成情況。對超過50個細胞的集落進行統(tǒng)計。

1.3.4 Transwell小室實驗檢測各組786-O細胞的侵襲和遷移數(shù)目：在Transwell小室中預涂Matrigel基質(zhì)膠50 μl，干燥備用。取各組處于對數(shù)期生長的786-O細胞，添加無血清的培養(yǎng)基重懸調(diào)整細胞密度為2.5×104個/ml，后吸取細胞懸浮液200 μl接種Transwell小室上室中，下室添加含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取出小室，使用PBS沖洗2～3次，添加甲醇固定細胞，后用棉簽輕輕擦拭掉上室細胞，將下室細胞用1%結(jié)晶紫染色30 min，在顯微鏡視野下觀察，分別選取左上、右上、中部、左下及右下5個視野，計算穿膜細胞數(shù)目。遷移實驗不需要添加基質(zhì)膠，其余操作方法同侵襲實驗。

2 結(jié) 果

2.1 不同細胞系中FKBP11表達水平比較 與正常腎小管上皮細胞系HK-2比較，RCC細胞系A498、ACHN、CaKi-1、786-O中FKBP11 mRNA和蛋白表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1、表1。其中FKBP11在786-O細胞中表達最高，故后續(xù)實驗以786-O細胞為研究對象。

圖1 Western blot檢測RCC細胞與正常腎小管上皮細胞中FKBP11蛋白表達水平

表1 正常腎小管上皮細胞與RCC細胞中FKBP11表達水平比較

2.2 各組786-O細胞中FKBP11表達水平比較 與對照組比較，si-FKBP11組FKBP11 mRNA和蛋白表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)；空白組與對照組，si-FKBP11組與si-FKBP11+LY364947組細胞中FKBP11的mRNA和蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2、表2。

表2 各組786-O細胞中FKBP11 mRNA和蛋白表達水平比較

2.3 各組786-O細胞增殖活力比較 細胞培養(yǎng)24 h后，各組786-O細胞的增殖活力比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；培養(yǎng)48、72 h后，與對照組比較，si-FKBP11組786-O細胞增殖活力明顯降低(P<0.05)；與si-FKBP11組比較，si-FKBP11+LY364947組786-O細胞增殖活力明顯降低(P<0.05)；而空白組與對照組786-O細胞增殖活力比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此外，集落形成實驗證實，與對照組比較，si-FKBP11組集落形成明顯減少(P<0.05)；與si-FKBP11組比較，si-FKBP11+LY364947組786-O細胞集落形成數(shù)量顯著降低(P<0.05)；而空白組與對照組786-O細胞集落形成數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學意義 (P>0.05)，見圖3、表3。

表3 各組786-O細胞增殖情況比較

A.空白組；B.對照組；C.si-FKBP11組；D.si-FKBP11+LY364947組

圖3 集落形成實驗檢測細胞增殖比較

2.4 各組786-O細胞侵襲和遷移能力比較 與對照組比較，si-FKBP11組786-O細胞中侵襲和遷移細胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)；與si-FKBP11組比較，si-FKBP11+LY364947組786-O細胞中侵襲和遷移細胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)；而空白組與對照組786-O細胞中侵襲和遷移細胞數(shù)目比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4、表4。

表4 各組786-O細胞侵襲和遷移細胞數(shù)目比較個)

圖4 各組786-O細胞侵襲和遷移實驗結(jié)果比較(×200)

2.5 各組786-O細胞中PCNA、E-cadherin、Vimentin、Twist和Snail蛋白表達水平比較 與對照組比較，si-FKBP11組786-O細胞中PCNA、Vimentin、Twist和Snail蛋白水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)；與si-FKBP11組比較，si-FKBP11+LY364947組786-O細胞中PCNA、Vimentin、Twist和Snail蛋白水平顯著降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白水平顯著升高(P<0.05)；而空白組與對照組786-O細胞中上述蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖5、表5。

表5 各組786-O細胞中PCNA、E-cadherin、Vimentin、Twist和Snail蛋白水平比較

注：A.空白組；B.對照組；C.si-FKBP11組；D.si-FKBP11+LY364947組

2.6 各組786-O細胞中TGF-β1、Smad3和p-Smad3蛋白表達水平比較 各組786-O細胞中Smad3蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組比較，si-FKBP11組786-O細胞中TGF-β1和p-Smad3蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與si-FKBP11組比較，si-FKBP11+LY364947組786-O細胞中TGF-β1和p-Smad3蛋白表達明顯降低(P<0.05)；而空白組與對照組786-O細胞中TGF-β1和p-Smad3蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖6、表6。

表6 各組786-O細胞中TGF-β1和Smad3、p-Smad3蛋白水平比較

注：A.空白組；B.對照組；C.si-FKBP11組；D.si-FKBP11+LY364947組

3 討 論

RCC發(fā)病率占成人惡性腫瘤的2%～3%，早期具有隱匿性，約30%的患者初診時就已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移[10-11]。傳統(tǒng)的化學療法和放射療法對RCC治療基本無效[2]，因此發(fā)現(xiàn)新的有效的診斷方法和治療方案尤為重要。

FKBPs是一類包含肽基普脯氨酸順式/反式異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)家族，可參與多種生物學功能，如心臟調(diào)節(jié)功能、神經(jīng)元的發(fā)育等，且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[7]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)KBP11可參與蛋白質(zhì)的折疊和分泌[12]。過表達的FKBP11是狼瘡B細胞的特征之一，可破壞B細胞的耐受性并導致漿細胞分化[13]。另外，F(xiàn)KBP11表達可隨著肝癌細胞的發(fā)展而逐漸增高，可成為肝細胞癌早期診斷的標志物之一[14]。此外，也有研究證明，F(xiàn)KBP11在腎透明細胞癌(ccRCC)組織中高表達，且其表達可隨著ccRCC病理分級的增高而升高，與ccRCC的發(fā)生發(fā)展密切相關[7]。但關于FKBP11在RCC中的作用機制還未見詳細報道。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)KBP11在RCC細胞系中高表達,與以往研究相似[7]，且在786-O細胞中FKBP11表達最高。進一步分析顯示，F(xiàn)KBP11下調(diào)可抑制786-O細胞的增殖、侵襲和遷移能力。同時結(jié)果表明，敲低FKBP11可降低PCNA、Vimentin、Twist、Snail蛋白水平，上調(diào)E-cadherin表達。已知PCNA主要在細胞核中表達，其蛋白水平可用來評估細胞的增殖狀態(tài)[15]。E-cadherin水平降低及Vimentin水平升高是上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)發(fā)生的重要標志[16]。以上結(jié)果說明，F(xiàn)KBP11可通過調(diào)控細胞行為相關蛋白的表達進而參與RCC的發(fā)生發(fā)展過程，但FKBP11在RCC中的作用機制尚不清楚。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個極為復雜的過程，可由多種信號通路參與調(diào)控，其中TGF-β1/Smad3信號通路為癌細胞發(fā)生發(fā)展的重要通路之一[17]。有研究證明，TGF-β1/Smad3促進腎臟炎性反應和纖維化發(fā)展[18]。此外有研究報道，雌激素受體β(ERβ)可通過激活TGF-β1/Smad3/miRNAs信號通路，進而影響EMT過程，促進RCC的侵襲和遷移作用，當此通路被抑制時，可逆轉(zhuǎn)ERβ促進RCC發(fā)展過程，從而為有效抑制轉(zhuǎn)移性RCC的新療法提供基礎[19]。據(jù)報道，Twist和Snail是TGF-β1/Smad3通路上游轉(zhuǎn)錄因子，當其水平升高可促進通路激活[20]。TGF-β1和p-Smad3的蛋白水平則可反映TGF-β1/Smad3通路狀況，當二者水平增高時，表示此通路被激活，反之則為抑制[21]。本研究結(jié)果顯示，敲低FKBP11表達抑制Twist、Snail、TGF-β1和p-Smad3蛋白水平，表明敲低FKBP11表達可能抑制TGF-β1/Smad3通路活化。進一步研究顯示，TGF-β1/Smad3通路抑制劑部分逆轉(zhuǎn)FKBP11下調(diào)對RCC細胞惡性行為及TGF-β1/Smad3通路的影響。以上結(jié)果表明，下調(diào)FKBP11抑制RCC細胞惡性細胞行為，可能與抑制TGF-β1/Smad3通路激活有關。

綜上所述，下調(diào)FKBP11可抑制RCC細胞的增殖、侵襲和遷移，其機制可能與抑制TGF-β1/Smad3通路活化有關。然而本研究并未探究下調(diào)FKBP11影響RCC的發(fā)生發(fā)展過程是否還有其他通路的參與，還有待后續(xù)更深入的探究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

張苗、張麗麗：構(gòu)思、設計研究方案；何德嬌、凌娜、李小麗：進行實驗操作；梁軼嵐、胡威：撰寫論文，分析或解釋數(shù)據(jù)；張苗：論文終審