衛(wèi)雪利，費英山，張銀娟，劉靜，馬金海

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一種惡性造血系統(tǒng)疾病，因造血功能被破壞，可引起貧血、感染、出血和組織浸潤等一系列臨床癥狀，我國每年新發(fā)兒童白血病1.5萬例，其中兒童ALL占70%～80%，是兒童最常見的惡性腫瘤[1-2]。盡管國際上對ALL有較統(tǒng)一的診斷標(biāo)準和不同系統(tǒng)治療方案，但仍有部分兒童ALL會出現(xiàn)復(fù)發(fā)，其病理生理機制是研究熱點。腫瘤發(fā)生發(fā)展是多基因、多因素參與的復(fù)雜過程，糖基磷脂酰肌醇錨附著蛋白1(glycosylphosphatidylinositol anchor attachment 1，GPAA1)是糖基磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移酶的關(guān)鍵亞基，參與糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨結(jié)合到前體蛋白質(zhì)上的過程，介導(dǎo)GPI錨定相關(guān)蛋白質(zhì)[3]。研究顯示，GPAA1過表達參與黑色素瘤、肝癌發(fā)生發(fā)展[4-5]。Endocan是一種內(nèi)皮細胞特異性分子，參與體內(nèi)炎性反應(yīng)、血管生成和細胞周期、遷移、凋亡等調(diào)控[6]。既往研究報道，Endocan在伴發(fā)熱性中性粒細胞減少癥的兒童血清中升高，有助于監(jiān)測白血病兒童有無發(fā)熱性中性粒細胞減少癥[7]。目前，關(guān)于GPAA1、Endocan mRNA與兒童ALL的關(guān)系和臨床意義尚不明確，本研究通過檢測ALL患兒血清GPAA1、Endocan mRNA表達，探討二者與兒童ALL臨床病理特征的關(guān)系及對ALL患兒復(fù)發(fā)的預(yù)測價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月—2021年1月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院兒內(nèi)科收治ALL患兒86例為ALL組，其中男53例，女33例；年齡2～14(7.20±1.23)歲，根據(jù)1年后是否復(fù)發(fā)分為未復(fù)發(fā)亞組70例與復(fù)發(fā)亞組16例。與未復(fù)發(fā)亞組比較，復(fù)發(fā)亞組ALL患兒免疫表型T-ALL、WBC≥50×109/L、混合譜系白血病(MLL)重排陽性、有淋巴結(jié)腫大、危險度分型中高危占比及血清GPAA1、Endocan mRNA水平升高(P<0.05)，而2組性別、年齡、血紅蛋白、BCR/ABL等比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。另選取同期醫(yī)院體檢健康兒童54例為健康對照組，男33例，女21例；年齡1～14(7.17±1.37)歲；2組兒童性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(2017-063)，受試兒家屬知情同意并簽署知情同意書。

表1 未復(fù)發(fā)亞組與復(fù)發(fā)亞組ALL患兒臨床資料比較

1.2 病例選擇標(biāo)準 (1)納入標(biāo)準：①符合“兒童急性淋巴細胞白血病診療規(guī)范(2018年版)”[8]診斷標(biāo)準；②初診，入院前未接受任何抗腫瘤治療；③接受中國兒童白血病協(xié)作組-ALL2008方案[9]治療；④年齡≤14歲。(2)排除標(biāo)準：①合并其他部位惡性腫瘤；②合并其他血液系統(tǒng)疾病；③合并免疫系統(tǒng)疾?。虎芟忍煨曰?；⑤合并嚴重心、肝、腎功能損害；⑥難治性ALL；⑦不能進行隨訪或中途失訪。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 血清GPAA1、Endocan mRNA表達檢測：收集ALL患兒確診當(dāng)日和健康對照組體檢時空腹靜脈血3 ml，離心留取血清保存于-80℃冰箱中待測。Trizol法(北京凱詩源生物科技有限公司)提取血清總RNA，TB Green Premix Ex TaqTM試劑盒(武漢科昊佳生物科技有限公司)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照SYBR Green qPCR Mix試劑盒(北京百邁客生物科技有限公司)說明書進行PCR擴增。引物設(shè)計合成由廣州銳博生物技術(shù)有限公司完成：GPAA1上游引物：5′- TCTCAAGGCTCTGGAACTG-3′，下游引物：5′-GCCCCACACCCTGTGATG-3′；GPAA1內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，下游引物：5′-TGCCGTAGGTGTCCCTTTG-3′；Endocan mRNA上游引物：5′-GGTGGACTGCCCTCAACACT-3′，下游引物：5′-AAGGTGCCGTAGGGACAGTCT-3′；Endocan內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3′，下游引物：5′-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。反應(yīng)條件：95℃ 90 s，95℃ 30 s、63℃ 30 s、72℃ 15 s，循環(huán)40次后進行熔融曲線分析，2-ΔΔCT法計算血清GPAA1、Endocan mRNA相對表達量。

1.3.2 隨訪情況：所有ALL患兒經(jīng)規(guī)范治療后通過電話或門診方式隨訪1年，觀察ALL患兒復(fù)發(fā)情況。以治療后再次出現(xiàn)骨髓中原始/幼稚淋巴細胞>5%定義為復(fù)發(fā)[8]。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清GPAA1、Endocan mRNA表達比較 ALL組血清GPAA1、Endocan mRNA表達水平為(8.36±2.29)、(5.62±1.13)，高于健康對照組的(4.07±1.50)、(2.37±1.03)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.375、17.485，P均<0.001)。

2.2 不同預(yù)后亞組間ALL患兒血清GPAA1、Endocan mRNA表達比較 復(fù)發(fā)亞組血清GPAA1、Endocan mRNA表達水平為(9.94±2.03)、(6.35±1.61)，高于未復(fù)發(fā)亞組的(7.39±2.31)、(4.96±1.25)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.069、3.791，P均<0.001)。

2.3 ALL患兒血清GPAA1 mRNA與Endocan mRNA表達的相關(guān)性 ALL患兒血清GPAA1 mRNA表達與Endocan mRNA表達呈正相關(guān)(r=0.564，P<0.001)。

2.4 ALL患兒復(fù)發(fā)的多因素Logistic回歸分析 隨訪1年， ALL患兒86例復(fù)發(fā)16例(18.60%)。以ALL患兒是否復(fù)發(fā)(是為“1”，否為“0”)為因變量，以免疫表型(T-ALL為“1”，B-ALL為“0”)、WBC(≥50×109/L為“1”，<50×109/L為“0”)、MLL重排(陽性為“1”，陰性為“0”)、淋巴結(jié)腫大(有為“1”，無為“0”)、危險度分型(中高危為“1”，低危為“0”)、GPAA1 mRNA(原值錄入)、Endocan mRNA(原值錄入)為自變量，建立多因素Logistic回歸模型。結(jié)果顯示，T-ALL、WBC≥50×109/L、MLL重排陽性、危險度分型中高危及血清GPAA1 mRNA升高、Endocan mRNA升高為ALL患兒復(fù)發(fā)的獨立危險因素(P<0.05)，見表2。

表2 ALL患兒復(fù)發(fā)的多因素Logistic回歸分析

2.5 血清GPAA1、Endocan mRNA表達預(yù)測ALL患兒復(fù)發(fā)的價值 繪制ROC曲線結(jié)果顯示，血清GPAA1、Endocan mRNA及二者聯(lián)合預(yù)測ALL患兒復(fù)發(fā)的AUC分別為0.786、0.784、0.866，二者聯(lián)合預(yù)測ALL患兒復(fù)發(fā)的AUC大于各項單獨預(yù)測(Z=2.574、2.919，P=0.010、0.004)，見表3、圖1。

圖1 血清GPAA1、Endocan mRNA表達單獨及聯(lián)合預(yù)測ALL患兒復(fù)發(fā)的ROC曲線

表3 血清GPAA1、Endocan mRNA表達預(yù)測ALL患兒復(fù)發(fā)的價值

3 討 論

ALL是起源于T系或B系淋巴細胞在髓內(nèi)異常增生的惡性腫瘤，其特征是造血細胞的克隆性增殖停滯在原始的低分化階段，細胞功能失調(diào)的白細胞進入血液循環(huán)后可滲入全身組織器官，導(dǎo)致正常血細胞數(shù)量逐漸減少[10]。目前，ALL發(fā)病機制仍未完全明確，可能與病毒感染、理化刺激、遺傳缺陷等有關(guān)[11]。盡管近年來隨著現(xiàn)代免疫學(xué)、分子生物學(xué)和遺傳技術(shù)的進步，對ALL病因和機制有了更深層的認識，臨床診斷和個體化治療方案不斷完善，兒童ALL的5年生存率可達90%，但仍有20%～30%的患兒可再次復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)的患兒生存率不足50%[12-14]。因此有必要進一步研究ALL患兒復(fù)發(fā)相關(guān)調(diào)控機制，對改善ALL患兒治療策略和預(yù)后十分重要。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾幾乎參與細胞所有的生命活動過程，能通過影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和其參與的分子網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)等，協(xié)同或競爭地調(diào)控蛋白質(zhì)功能，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展[15]。GPI與蛋白質(zhì)C末端以共價形式相連接，是真核生物中一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，GPI修飾的蛋白質(zhì)能通過GPI錨定于細胞膜的外葉，調(diào)節(jié)錨定蛋白結(jié)構(gòu)和功能，參與炎性反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)錄、蛋白降解、染色體穩(wěn)定、細胞增殖、細胞死亡等生物學(xué)過程[16]。既往研究證實，GPI能通過錨定癌胚抗原參與腫瘤進展，也能通過錨定基質(zhì)金屬蛋白酶促進腫瘤細胞上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。糖基磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移酶是GPI錨合成不可缺少的物質(zhì)，GPAA1則是糖基磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移酶的一個關(guān)鍵亞基，自身不參與GPI錨合成，但能通過催化GPI末端與蛋白質(zhì)C末端形成酰胺鍵，使GPI錨定蛋白質(zhì)[3]。GPAA1參與促進GPI錨定蛋白質(zhì)，而GPI能通過錨定相關(guān)蛋白參與腫瘤發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌中GPAA1過表達能促進GPI錨定相關(guān)蛋白以激活ERBB信號通路，促進胃癌生長和轉(zhuǎn)移[18]。然而關(guān)于GPAA1與兒童ALL的關(guān)系尚不明確。本研究結(jié)果顯示，ALL患兒血清GPAA1 mRNA表達明顯上調(diào)，為ALL患兒復(fù)發(fā)的獨立危險因素，說明GPAA1 mRNA參與兒童ALL發(fā)生發(fā)展。其機制可能與GPAA1高表達能促進GPI錨定蛋白表達，激活c-myc基因有關(guān)。c-myc是一種原癌基因，能通過擴增和染色體易位重排方式激活，參與包括ALL在內(nèi)的幾乎所有的惡性腫瘤進展[19]。Zhang等[20]研究發(fā)現(xiàn)，GPAA1與c-myc均定位于人染色體8q24，熒光素酶報告基因證實GPAA1能靶向上調(diào)c-myc促進ALL細胞惡性進展。

盡管ALL是一種“液體”腫瘤，但ALL仍然存在骨髓血管新生現(xiàn)象，骨髓血管新生能通過增加骨髓血管密度促進ALL進展[21]。血管內(nèi)皮細胞的新陳代謝對骨髓血管新生至關(guān)重要，Endocan是主要由活化細胞分泌并受多種細胞因子調(diào)節(jié)的可溶性硫酸皮膚素糖蛋白，能通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與炎性反應(yīng)、血管生成、維持血管內(nèi)皮完整等眾多病理生理過程[22]。既往研究發(fā)現(xiàn)，Endocan能介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通過促進血管新生參與糖尿病視網(wǎng)膜病變進展[23]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Endocan介導(dǎo)的血管新生等過程也參與多種惡性腫瘤進展，如Endocan能通過介導(dǎo)VEGF誘導(dǎo)浸潤性膀胱癌血管生成，促進腫瘤進展[24]。在乳腺癌耐藥性研究中，Endocan過表達能增加乳腺癌放療耐藥性，敲除Endocan能抑制乳腺癌細胞增殖和侵襲[25]。本研究結(jié)果顯示，ALL患兒血清Endocan mRNA表達明顯上調(diào)，分析是ALL患兒因血液系統(tǒng)異常引起的血小板異常、凝血因子異常、白細胞浸潤等損傷血管內(nèi)皮，導(dǎo)致血管內(nèi)皮活化釋放Endocan。進一步分析顯示，血清Endocan mRNA高表達為ALL患兒復(fù)發(fā)的獨立危險因素，說明Endocan mRNA參與兒童ALL發(fā)生發(fā)展。分析與Endocan能通過介導(dǎo)VEGF促進骨髓血管新生，進而促進ALL進展有關(guān)。VEGF是介導(dǎo)血管新生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，參與白血病骨髓血管新生過程，Endocan能通過磷脂酰肌醇3-激酶途徑上調(diào)VEGF表達[26]。本研究結(jié)果還顯示，T-ALL、WBC≥50×109/L、MLL重排、危險度分型中高危也能獨立影響ALL患兒復(fù)發(fā)，分析原因：研究表明，T-ALL在確診時至少屬于中危危險度分型，且在誘導(dǎo)緩解過程中對藥物反應(yīng)不如B-ALL敏感，因此更容易復(fù)發(fā)[14]。WBC增加是ALL患者最常見表現(xiàn)，與造血細胞惡性增生進入外周血循環(huán)有關(guān)，WBC越高反映ALL患兒髓內(nèi)異常增生越嚴重，因此復(fù)發(fā)風(fēng)險更高。MLL重排能通過產(chǎn)生嵌合基因促進致癌融合蛋白轉(zhuǎn)錄，對白血病細胞增殖和自我更新具有重要作用，研究顯示，盡管MLL重排在兒童ALL中發(fā)生率較低，但79%的ALL患兒復(fù)發(fā)與其相關(guān)[27]。危險度分型是臨床常用的兒童ALL危險度分組標(biāo)準，中高危反映ALL患兒初始腫瘤細胞遺傳學(xué)特征更嚴重，對治療的敏感性更差，因此復(fù)發(fā)風(fēng)險增加[8]。本研究通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ALL患兒血清GPAA1 mRNA表達與Endocan mRNA表達呈正相關(guān)，提示GPAA1可能和Endocan共同參與ALL患兒復(fù)發(fā)，其機制可能是GPAA1能促進GPI錨定Endocan蛋白質(zhì)，促進Endocan表達，但具體機制還需進一步研究。最后本研究通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清GPAA1、Endocan mRNA可單獨作為ALL患兒復(fù)發(fā)的預(yù)測指標(biāo)，且聯(lián)合檢測血清GPAA1、Endocan mRNA表達能提升預(yù)測價值，但仍需多中心大樣本研究證實。

綜上所述，ALL患兒血清GPAA1、Endocan mRNA表達升高，為ALL患兒復(fù)發(fā)的獨立危險因素，可作為ALL患兒復(fù)發(fā)的輔助預(yù)測指標(biāo)，且二者聯(lián)合能提升輔助預(yù)測價值。由于研究時間限制，未進一步分析血清GPAA1、Endocan mRNA表達與兒童ALL長期預(yù)后的關(guān)系，有待進一步深入研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

衛(wèi)雪利：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；費英山：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計學(xué)分析，論文審核；張銀娟：實施研究過程，資料搜集整理，論文修改；劉靜：課題設(shè)計，論文修改；馬金海：設(shè)計研究方案，論文審核