翟孟婷， 謝 亮， 林澤峰， 張江旭， 王翔宇,2， 惠 菊,2

(中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室1，北京 102209) (江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心2，南京 210023)

甾醇是天然甾族化合物中的一類物質(zhì)，按照來源可分為動物甾醇、植物甾醇和菌甾醇。植物甾醇是一種天然活性物質(zhì)，通常為無色、無味、不溶于水、易溶于有機(jī)物，結(jié)構(gòu)上與膽固醇相似[1]。植物甾醇主要來源于植物類食物，且大部分存在于油料種子中[2]。食用植物油中含有多種甾醇，甾醇含量相對較多的為稻米油、玉米油、葵花籽油、菜籽油，主要甾醇種類為菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇。植物甾醇應(yīng)用范圍很廣，有助于降低血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇以及血清甘油三酯的濃度，添加到化妝品中可提高乳化穩(wěn)定性，添加到飼料中可以提高禽畜的增重率[1]。目前食用植物油中甾醇提取方法主要為堿溶液加熱皂化提取結(jié)合液液萃取法[3，4]，薄層色譜法[5]或固相萃取法[6，7]凈化提純后上機(jī)測定。文獻(xiàn)報(bào)道的甾醇分析方法主要有氣相色譜法[6-8]，氣相色譜質(zhì)譜法[9，10]，液相色譜法[11，12]，液相-氣相色譜聯(lián)用法[13，14]。氣相色譜法的分離度和靈敏度相對較好，設(shè)備價格相對較低且對操作人員要求不高等優(yōu)勢，國家標(biāo)準(zhǔn)中使用堿液皂化-氧化鋁柱除雜-薄層板分離提純結(jié)合氣相色譜定量國家標(biāo)準(zhǔn)方法具有適用性廣，甾醇凈化率高的優(yōu)勢，但因操作過程繁瑣且耗時長，無法批量處理。氣相色譜質(zhì)譜法靈敏度和抗干擾力較強(qiáng)，是近幾年甾醇分析使用較多的方法。液相色譜對甾醇的分離穩(wěn)定性相對較差，有文獻(xiàn)報(bào)道液相-氣相色譜聯(lián)用法，液相色譜對樣品進(jìn)行分離，收集洗脫結(jié)合氣相色譜進(jìn)行測定完成15種甾醇組分的分析，樣品前處理相對簡單易操作，但分析時間較長對設(shè)備的要求比較高，不能滿足快速測定需求[13]。

本研究選擇前處理方法簡單且設(shè)備靈敏度和分離度能滿足要求的檢測方法，在改進(jìn)國家標(biāo)準(zhǔn)方法基礎(chǔ)上，優(yōu)化樣品前處理過程，人員實(shí)驗(yàn)技能要求較低同時滿足油脂工廠快速測定甾醇的要求，結(jié)合氣相色譜完成甾醇化合物分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

甾醇標(biāo)品∶膽固醇99%，菜籽甾醇，豆甾醇，菜油甾醇，β-谷甾醇。

衍生化試劑(BSTFA∶TMCS=99∶1)，正己烷，色譜純； 95%乙醇，分析純；氫氧化鉀， 無水硫酸鈉，15 mL塑料離心管。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B氣相色譜-FID檢測器，HP-5色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，TTL-DC11氮吹儀，ST-16R離心機(jī)，水浴鍋，渦旋混合器，ME-204天平。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱量100 mg膽固醇標(biāo)品(準(zhǔn)確到0.100 mg)，用正己烷溶解，于25 mL容量瓶中定容。將溶液轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，密封后，置于-20 ℃保存1周。

菜籽甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.00 mg/mL)：分別準(zhǔn)確稱量5 mg甾醇標(biāo)品(準(zhǔn)確到0.100 mg)，用正己烷溶解，于5 mL容量瓶中定容。將溶液轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，密封后，在-20 ℃保存3個月。

菜油甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.10 mg/mL)：稱量1 mg菜油甾醇標(biāo)品，取少量正己烷于標(biāo)準(zhǔn)品瓶中重復(fù)3次，將標(biāo)準(zhǔn)品溶解后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，密封后，在-20 ℃保存3個月。

甾醇工作溶液：量取1 mL菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液于進(jìn)樣瓶中衍生化后，氣相色譜定性分析。

1.3.2 樣品處理

稱取200 mg樣品于15 mL離心管中，依次加入500 μL內(nèi)標(biāo)溶液，2 mol/mL氫氧化鉀-乙醇溶液1 mL，渦旋1 min，混勻，超聲3 min，取出后加入4 mL KOH-乙醇溶液，渦旋1 min后放入60 ℃水浴鍋中加熱1 h，取出后冷卻。加入2 mL去離子水，5 mL正己烷，渦旋后4 000 r/min離心10 min，將上層溶液轉(zhuǎn)移至另一15 mL離心管中，重復(fù)提取2次，加入1 g無水硫酸鈉。將提取液氮吹至2 mL，離心后過0.22 μm有機(jī)濾膜，轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，氮吹至干，再加入400 μL衍生化試劑，60 ℃水浴加熱1 h，上機(jī)分析。

1.3.3 氣相色譜條件

HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，載氣：高純氮?dú)?，純?9.999%；恒壓，16.349 psi；分流比：20∶1；進(jìn)樣口溫度：320 ℃；檢測器溫度：320 ℃；程序升溫：初始溫度240 ℃，保持1 min，以4℃/min的速率從240 ℃升溫到255 ℃，保持35 min；進(jìn)樣量：1.0 μL。

1.3.4 結(jié)果計(jì)算

本方法的甾醇總量計(jì)算方法，參考GB/T 25223—2010，甾醇總量的計(jì)算從菜籽甾醇到Δ7-燕麥甾烯醇所有甾醇的峰。

式中：S為試樣中甾醇總量，以100 g油中含有的質(zhì)量表示/mg/100 g；mB為膽固醇的質(zhì)量/mg；Σ(A)為單體甾醇峰面積的和;AB為膽固醇內(nèi)標(biāo)峰面積；mT為試樣的質(zhì)量/g。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

本文樣品測定方法的甾醇總量計(jì)算方法參考GB/T 25223—2010，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel表分析，用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 堿液濃度

稱取200 mg樣品按照分別添加0.5、1、2、2.5 mol/mL濃度堿液5 mL，進(jìn)行樣品前處理后上機(jī)分析。探究堿液濃度對甾醇含量的影響，結(jié)果見圖1。堿液濃度增加有助于皂化物的提取，堿液濃度2.5 mol/mL 和2 mol/mL時，甾醇總量值上升為最大值，堿液濃度過高時，溶液黏度略大，不利于萃取，因此濃度為2 mol/mL最優(yōu)。

2.1.2 提取溶劑用量

因乙醚與乙醇容易發(fā)生乳化反應(yīng)，回收率略低于正己烷[15]。本實(shí)驗(yàn)選擇正己烷為提取溶劑，并對正己烷的用量進(jìn)行探究。核桃油中豆甾醇本底值較低為14.25 mg/kg。稱取核桃油200 mg，添加豆甾醇標(biāo)品200 μg，按照1.3.2進(jìn)行前處理，選取正己烷4、8、10、12 mL對皂化液進(jìn)行2次萃取，上機(jī)分析。豆甾醇回收率隨著正己烷用量增加而增高在10 mL后開始。在本實(shí)驗(yàn)條件下，正己烷用量4 mL時，有乳化現(xiàn)象分層不明顯。當(dāng)正己烷用量8、10 mL時回收率最高，分別為99.72%、100.21%，過多的提取液在氮吹濃縮耗時較長因此本實(shí)驗(yàn)選擇使用正己烷8 mL，結(jié)果見圖1。

圖1 堿液濃度以及正己烷用量對甾醇的影響

2.1.3 前處理?xiàng)l件對結(jié)果影響探究

薄層色譜分離可以將不皂化物中的甾醇與烴類、三萜烯醇和甲基甾醇等分開，其分離效果影響甾醇結(jié)果的準(zhǔn)確性[16]。本研究省略薄層色譜分析步驟，具有快速測定批量處理的優(yōu)勢，探究本方法與GB/T 25223—2010測定甾醇總量結(jié)果差異，選取2個玉米毛油結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見表1。對2個樣品的2個總體均值之差檢驗(yàn)，計(jì)算的2個P值，均大于P=0.05，因此2種檢測方法差異性不顯著。

表1 2種方法測定玉米油中甾醇總量表

2.2 色譜分離

本實(shí)驗(yàn)使用Aglient HP-5非極性毛細(xì)管柱，具有良好的惰性和熱穩(wěn)定性，可以較短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)甾醇完全分離。菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖，如圖2所示。

注：1 菜籽甾醇；2 菜油甾醇；3 豆甾醇；4 β-谷甾醇。圖2 4種甾醇標(biāo)品色譜圖

2.3 甾醇鑒定

國家標(biāo)準(zhǔn)方法中將氫氣作為載氣，使用SE-54色譜柱進(jìn)行分離給出甾醇的相對保留時間，因氫氣在實(shí)驗(yàn)室安全風(fēng)險系數(shù)較高，對氣體儲存要求極高，不適用于一般實(shí)驗(yàn)室。所以本方法使用氮?dú)庾鳛檩d氣， HP-5色譜柱分離測定相對保留時間(RRT)鑒定植物油中的甾醇種類，以待測甾醇保留時間除以膽固醇的保留時間(RT)，表2列出了在本實(shí)驗(yàn)條件下12種甾醇的相對保留時間。

表2 甾醇相對保留時間表

表3 方法添加回收率

表4 4種食用植物油中甾醇含量測定值/mg/kg

表5 6種食用植物油中甾醇含量測定值/mg/kg

2.4 回收率和精密度

考慮樣品本底值的基礎(chǔ)上，對核桃油進(jìn)行4類甾醇3種濃度水平進(jìn)行3次添加回收實(shí)驗(yàn)，其中菜籽甾醇回收率為85.42%～91.44%，菜油甾醇回收率為87.51%～91.89%，豆甾醇回收率為89.25%～98.10%，β-谷甾醇回收率為85.13%～94.80%，該方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.43%～3.72%。β-谷甾醇低濃度添加回收率略低，可能與樣品本底值較高有關(guān)，詳見表3。

2.5 方法檢出限和定量限

本文保證結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，樣品加入內(nèi)標(biāo)定量。標(biāo)品儲備液逐級稀釋，以3倍信噪比(S/N)計(jì)算方法的檢出限(LOD)為0.11 mg/kg，10倍信噪比計(jì)算定量限(LOQ)為0.25 mg/kg。

2.6 不同植物油中的甾醇含量

食用植物油中主要以菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇為主。由表4、表5可知，菜油甾醇在7種油中含量較高，β-谷甾醇在10種油中含量最高，豆甾烯醇在山茶油、胡麻籽油和芝麻油中含量較高，菜油甾烯醇僅在稻米油中檢出?；ㄉ汀⒖ㄗ延?，山茶油和胡麻籽油甾醇總量在2 839～4 798 mg/kg范圍內(nèi)，核桃油甾醇總量最低為1 794.22 mg/kg。稻米油甾醇總量最高為22 082mg/kg，其次為玉米油11 000～13 000 mg/kg，這2種油的Δ5-燕麥甾烯醇和Δ5，24-豆甾烯醇含量高于其他品類油。

3 結(jié)論

本文建立快速測定油脂中甾醇方法，在國家標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，樣品氫氧化鉀乙醇溶液加熱皂化后少量正己烷提取，氮吹濃縮衍生反應(yīng)后，利用氣相色譜進(jìn)行12種甾醇分析。本方法簡便高效，適合高通量處理且減少有機(jī)試劑使用量，節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本同時對實(shí)驗(yàn)人員友好健康，滿足油脂工廠快速測定甾醇的需求。