包澤偉， 林建原， 張 瑱， 于佩斕， 劉 樂

(浙江萬里學(xué)院，寧波 315100)

山茶起源于我國云貴高原，國內(nèi)種植比例占全球95%。山茶樹大致分布于亞洲東部及東南部地區(qū)[1]，多見于山區(qū)丘陵地帶。我國對于油茶種植的政策支持力度持續(xù)增大，目前種植面積約為6.3×107萬畝，高產(chǎn)油茶林高達(dá)1.4×107萬畝，年產(chǎn)量約為6.3×105t[2-4]。山茶籽油中主要成分為多不飽和脂肪酸與低級飽和脂肪酸，此外還有許多生物活性物質(zhì)如茶多酚、茶皂素、角鯊烯等，具有一定抗衰老和抗菌作用，被廣泛應(yīng)用于食品、保健品、化妝品以及醫(yī)藥等行業(yè)[5,6]。

超聲波輔助酶水解山茶籽油提取工藝能在提高其提取率的條件下，免于有機(jī)溶劑等污染，降低食用中毒風(fēng)險，同時還能保存大部分山茶籽中山茶皂苷、茶多酚等活性物質(zhì)，相比于傳統(tǒng)壓榨提油工藝具有提取條件溫和、無需二次提取、耗能低、廢氣排放少等優(yōu)勢，其浸出、去雜和精煉工藝步驟更為簡單，可大幅度降低對設(shè)備的投資[7]，成為新時代環(huán)境友好工業(yè)發(fā)展的必經(jīng)之路[8]。

研究表明，酶種類的選擇對最終游離油得率起決定作用。Fang等[9]采用水酶法提取山茶籽油，通過比較多種酶對提取率的影響發(fā)現(xiàn)，使用中性蛋白酶與纖維素酶對油脂的提取率明顯高于其他方法，目前此方法的提取率仍受乳化現(xiàn)象等問題的影響。馮紅霞等[10]通過超聲酶法在0.6 mm物料顆粒、60 ℃酶解溫度、3 h酶解時間及2%酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)等條件下，以減少乳狀液的方式使游離油提取率達(dá)59.2%。本實驗采用超聲酶解與破乳等步驟減少了水酶法乳化的影響，通過BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與響應(yīng)面預(yù)測確定與實際更加擬合的方法，使推算最佳工藝更為準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山茶籽，2021年購于浙江省開化縣；氫氧化鉀、無水乙醇、石油醚、無水硫酸鈉：分析純；甲醇、正庚烷：色譜純；37種脂肪酸甲酯混合標(biāo)樣，純度≥99.0%；中性蛋白酶(100 U/mg)。

Eppendorf AG 22331 Hamburg型高速冷凍離心機(jī)，TYQ2-IIDN型超聲細(xì)胞粉碎機(jī)，VERTEX70型傅里葉變換紅外光譜儀，8890 GC型快速探針桿，7697A型頂空進(jìn)樣器，7693A型自動液體進(jìn)樣器。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲波輔助酶解提取山茶籽油工藝

1.2.2 山茶籽油單因素實驗

對超聲功率、超聲溫度、超聲時間、料液比、酶解時間進(jìn)行單因素實驗設(shè)計。各單因素四梯度設(shè)計：料液比：1∶3～1∶7.5 g/mL；超聲時間：5～35 min；超聲溫度：15～45 ℃；超聲功率：50～350 W；酶解時間：1～5.5 h；單因素其他條件分別選擇：1∶5 g/mL，25 min，180 W，3 h。并將每項最佳水平設(shè)為下一項固定值。設(shè)計空白對照實驗：料液比1∶4.5 g/mL；酶解時間3 h。

1.2.3 山茶油理化指標(biāo)測定

總油脂含量測定：GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》[11]。

1.2.4 山茶油成分分析測定

稱量樣品100 mg于50 mL的比色管中，加入0.125 mol/L KOH-CH3OH溶液5 mL，放置于85 ℃水浴鍋中搖晃5 min；加入14% BCl3-CH3OH溶液5 mL,放置于85 ℃水浴鍋中不斷搖晃5 min；加入正庚烷5 mL，加熱3 min，再加入Na2SO45 g，充分振蕩。取上清液置于進(jìn)樣小瓶中進(jìn)行GC-MS分析[12]。GC-MS儀器分析使用1.0 mL/min流速，10∶1分流比，200 ℃進(jìn)樣口溫度，EI電離方式，程序升溫為100 ℃ 2 min，10 ℃/min至160 ℃；0.4 ℃/min至180 ℃；4 ℃/min至240 ℃保持15 min[13-15]。

1.2.5 響應(yīng)面設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果并通過Design Expert 12 設(shè)計響應(yīng)面實驗表，結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計

1.2.6 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立

BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是一種模擬大腦進(jìn)行運算的特殊方式，分為輸入層、隱藏層、輸出層,每層之間相互關(guān)聯(lián)，但同層各因素之間沒有聯(lián)系[16]。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在其基礎(chǔ)上增加反向調(diào)節(jié)功能，即當(dāng)正向計算時產(chǎn)生的誤差大于設(shè)定值時反向傳遞信號，通過修改隱藏層權(quán)值以減小誤差直到小于設(shè)定值的運作方式，該網(wǎng)絡(luò)具有操作簡單、誤差小等優(yōu)點[16]。BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的建立使用Matlab2021a軟件，不同影響因素樣本共計17個，其中74%樣本用于模型訓(xùn)練，13%樣本用于驗證訓(xùn)練，13%樣本用于測試，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)搭建如圖1所示[17]。

注：X1～X3為輸入層3種影響因素；為隱藏神經(jīng)元；Y為輸出值提取率/%；ε為設(shè)定誤差值。圖1 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)與構(gòu)建流程圖

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

根據(jù)表1進(jìn)行單因素實驗設(shè)計，空白對照組提取率為11.2%。相較與空白組實驗，隨著超聲時間及超聲功率的加大，使得對細(xì)胞粉碎強(qiáng)度增大，進(jìn)而解除了蛋白質(zhì)、多糖對油脂的包裹，而提取溶劑占比在較時由于無法形成超聲對流，提取效果有較大影響，隨著占比增提高增加了液體流動性，蛋白酶能更好與底物進(jìn)行接觸，利于提高提取率，但隨著溶劑占比繼續(xù)提高，使酶無法與底物充分接觸，導(dǎo)致提取率下降。超聲溫度對山茶籽油提取率的影響說明溫度改變了物料中蛋白質(zhì)、皂素的結(jié)構(gòu)影響油脂提取率。由于酶解時間的提高，進(jìn)一步破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)降解為多肽釋放更多油脂，則最優(yōu)條件為：超聲時間25 min，超聲功率250 W，酶解時間4 h，料液比1∶4.5 g/mL，超聲溫度35 ℃。

圖2 單因素實驗結(jié)果

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

在單因素結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計，二次模型方差見表2。

表2 二次模型方差分析

由表2可知，該模型F值為22.47，P值為0.002，表示此模型顯著。其中A、C、A2、B2、C2的P值均小于0.01，說明差異極顯著。通過響應(yīng)面軟件分析可得到模型。

Y=-216.564+41.501A+0.756B+34.308C+0.007AB-0.094AC-0.031BC-4.592 59A2-0.001B2-3.092C2

該模型最優(yōu)解為料液比4.68 g/mL，超聲功率258.51 W，酶解時間4.19 h，提取率為50.05%。

2.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)果分析

數(shù)據(jù)選擇為隨機(jī)選擇，以均方誤差為性能判定，分別選擇3～12個隱藏神經(jīng)元進(jìn)行1 000次訓(xùn)練[18]。神經(jīng)元數(shù)量與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)準(zhǔn)確度密切相關(guān)，當(dāng)神經(jīng)元數(shù)量較低時網(wǎng)絡(luò)的自由度不足時無法準(zhǔn)確計算條件與結(jié)果的關(guān)系，神經(jīng)元數(shù)量過多會使計算量龐大，耗時更長甚至降低準(zhǔn)度。如表3所示，當(dāng)隱藏神經(jīng)元數(shù)量為5時訓(xùn)練誤差最小為0.028(均方誤差越低越好，0代表沒有誤差)。

圖3表明，選擇3×5×1網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)回歸系數(shù)均為0.997。該網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)具有良好相關(guān)性，能準(zhǔn)確模擬超聲波輔助酶法提取山茶籽油工藝提取率與3種因素之間的關(guān)系。

表3 隱藏神經(jīng)元個數(shù)篩選

圖3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練誤差圖與回歸系數(shù)

2.4 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與響應(yīng)面比較

響應(yīng)面及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)回歸預(yù)測結(jié)果如圖4所示。表4為分別通過響應(yīng)面設(shè)計、BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行最佳工藝預(yù)測并與實際提取率相比的結(jié)果。

響應(yīng)面能通過圖形與函數(shù)的直觀反映實驗快速得出各因素對結(jié)果的影響。但是由于本實驗中3種因素分別都能對提取率造成較大影響并能二次交互，相較于響應(yīng)面的多元二次計算，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)通過多次模擬訓(xùn)練更能實現(xiàn)結(jié)果仿真且在最優(yōu)條件下得出提取率較高，實際值與預(yù)測值誤差較小。通過其預(yù)測最佳工藝，表明該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)能有效優(yōu)化超聲輔助酶解法提取山茶籽油工藝。

圖4 17組人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與響應(yīng)面回歸預(yù)測

表4 最優(yōu)條件下響應(yīng)面與神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)提取率比較

圖5 山茶籽油紅外吸收光譜圖

2.5 紅外吸收光譜對山茶籽油脂肪酸成分分析

山茶籽紅外吸收光譜圖分析：在3 005.31 cm-1處有強(qiáng)度較弱的吸收譜帶，可能為不飽和C—H鍵的伸縮振動；在1 746.58 cm-1附近有吸收強(qiáng)度較強(qiáng)的吸收譜帶，可能為羰鍵的伸縮振動；在1 164.28 cm-1附近有吸收譜帶，可能為醚鍵的對稱伸縮；在2 925.35 cm-1和2 854.42 cm-1附近有2個強(qiáng)度較高的吸收譜帶，可能為飽和C—H鍵的伸縮振動；在1 464.51 cm-1和1 377.51 cm-1，可能存在—CH2—的不對稱剪式振動和—CH3的彎曲振動。在722.82 cm-1附近有中強(qiáng)度的吸收譜帶，說明存在長鏈飽和烴(n≥4)[19，20]。

2.6 GC-MS對山茶籽油脂肪酸成分分析

將脂肪酸進(jìn)行甲酯化，設(shè)定色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行測定，并通過NISTI7.L數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，各組分含量如表5所示。

表5 山茶籽中脂肪酸甲酯化合物含量

3 結(jié)論

采用超聲波輔助酶解山茶籽油提取工藝，結(jié)果表明，可表明超聲波與中性蛋白酶的結(jié)合作用能起到良好的破碎細(xì)胞、降低對油脂的包裹、提高油脂提取率等作用。通過構(gòu)建響應(yīng)面與BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)其預(yù)測值的標(biāo)準(zhǔn)誤差比響應(yīng)面預(yù)測降低0.39%，能更好地反映提取因素對提取率的影響。經(jīng)GC-MS測定得知山茶籽油脂肪酸主要為油酸89.36%、棕櫚酸6.27%、亞油酸2.25%、硬脂酸1.79%、順式-十八烷酸0.34%，山茶籽油不飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到89.70%，是優(yōu)質(zhì)的可食用植物油。