周冰謙 ，楊國紅 ，盧 恒 ，宋祥云 ，劉 峰 ，2，耿巖玲 ，2，王 曉 ，2，劉 偉 ，2，李圣波

（1.齊魯工業(yè)大學(xué)/山東省科學(xué)院，山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南 250014；2.齊魯工業(yè)大學(xué)/山東省科學(xué)院藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；3.山東亞特生態(tài)技術(shù)股份有限公司，山東 臨沂 276017）

中藥木瓜為薔薇科植物貼梗海棠Chaenomeles speciose （Sweet） Nakai 的干燥近成熟果實(shí)［1］，其氣微清香，味酸，具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕功效，主要用于治療濕痹拘攣、腰膝關(guān)節(jié)酸重疼痛、暑濕吐瀉、轉(zhuǎn)筋攣痛、腳氣水腫。 中國作為木瓜屬植物的起源中心，已有 3000 多年的栽培歷史［2］，木瓜原生種全世界共有 5 種，有 4 種原產(chǎn)于中國［3］，其中載入《中國藥典》的為皺皮木瓜（貼梗海棠），但臨床上仍有其余幾種混用的現(xiàn)象。 由于木瓜栽培具有分布廣、品種多等特點(diǎn)，其被引種到自然分布區(qū)以外時(shí)，為了適應(yīng)新的生態(tài)地理環(huán)境條件，外觀形態(tài)會發(fā)生較大變化，因此出現(xiàn)木瓜同種間形狀多樣、鑒別困難等問題［4］。

花粉作為攜帶大量遺傳信息的雄性生殖細(xì)胞，受基因型控制，是植物系統(tǒng)發(fā)育過程中較保守的器官，不易受外部自然環(huán)境影響［5］，因此可作為探討植物起源進(jìn)化、種屬鑒別及親緣關(guān)系鑒定的重要依據(jù)。本研究對采集的19 種木瓜花粉進(jìn)行電鏡掃描觀察及系統(tǒng)聚類分析，以期為揭示木瓜的親緣關(guān)系和中間分類鑒別提供孢粉學(xué)資料，并為木瓜藥用植物新資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于孢粉學(xué)研究的19 種木瓜花均于2019 年4月10 日至11 日采自山東亞特藥用植物生態(tài)園木瓜種質(zhì)資源庫，編號分別為YT001～YT004、YT012～YT013、YT018～YT021、YATS184～YATS185、YATS198～YATS199、YATS219、YATS336 及 YATS367～YATS369。原植物經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳教授鑒定為木瓜屬。

1.2 方法

將19 種木瓜的全開花剝?nèi)』ㄋ幹糜诒恿蛩峒埳?，室溫下陰干，將花粉均勻彈撒后，用雙面導(dǎo)電膠固定在樣品托上進(jìn)行噴金處理，利用掃描電子顯微鏡，觀察花粉性狀、對稱性、赤道面、極面觀特征、花粉形狀及外壁紋飾類型等特點(diǎn)，并隨機(jī)選取花粉20 粒，測量極軸長（P）、赤道軸長（E）、萌發(fā)溝長，計(jì)算P/E 值。 根據(jù)觀測結(jié)果，以供試的19 個(gè)品種作為分類運(yùn)算單位進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用 Screen Compass V4.0 軟件進(jìn)行花粉 P、E的測量，Excel 軟件用于處理數(shù)據(jù)，SPSS 20.0 軟件用于數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種木瓜花粉顯微形態(tài)特征分析

對不同種木瓜的花粉進(jìn)行電鏡掃描分析，結(jié)果表明發(fā)育良好的成熟木瓜花粉為單粒花粉，按照NPC分類系統(tǒng)［基于萌發(fā)器官的數(shù)目（N）、位置（P）和特征（C）的分類系統(tǒng)］進(jìn)行對照，屬于N3P4C3型，外形為超長球形或長球形，赤道面觀為不規(guī)則長方形或橢圓形，極面觀為三裂圓形或三裂橢圓形。 萌發(fā)器官為沿極軸方向的3 條等間距分布的孔溝，在赤道面可觀察到2 條，在極面可以看到3 條，溝寬各異。見圖1。

圖1 木瓜花粉粒的顯微電鏡圖

對19 種木瓜花粉進(jìn)行顯微形態(tài)特征觀察及描述，P 為 28.25～51.11 μm，E 為 16.49～26.58 μm，P/E 值 1.24～2.40，萌發(fā)溝長/極軸長為 0.62～0.97。 外壁紋飾類型條紋-腦紋狀紋飾或腦紋狀紋飾，穿孔的數(shù)目不同。 見表 1、表 2。

表1 19 種木瓜樣品的花粉形態(tài)特征

表2 19 種木瓜樣品的花粉微觀形態(tài)特征

2.2 木瓜花粉的聚類分析

對 19 種木瓜花粉的 P、E、P/E、萌發(fā)溝、萌發(fā)溝/極軸5 個(gè)定量指標(biāo)及花粉形狀、赤道面特征、極面觀特征3 個(gè)定性指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，得到譜系聚類圖，見表4、圖2。 在等級結(jié)合線L1 處 19 個(gè)品種被劃分為3 大組，其中第Ⅰ類組中4 個(gè)品種（YT002、YATS184、YATS219、YATS367）與另外 4 個(gè)品種（YA TS198、YT018、YT003、YT001）緊密聚類，說明其親緣關(guān)系近；第Ⅱ組包括 YT020、YT021、YATS185 及YATS336、YT012、YATS369、YT019，其中 YT020 與YT021 之間相似度更大，此結(jié)果與YATS336、YT012和YATS369 聚類結(jié)果相似，表明這3 種類型相似度最大，可能存在較近的親緣關(guān)系；第Ⅲ組分類包括YT004、YATS368、YATS199 與 YT0139 聚成一類，其中 YT004、YATS368 和 YATS199 這三個(gè)品種緊密聚類，說明這三者間的相似度很大。 第Ⅱ組與第Ⅲ組之后在遺傳距離15.0 處聚類，可知這兩組其相似性有限；其后在遺傳距離25.0 處與第Ⅰ組聚成一類，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 19 種木瓜樣品的花粉性狀聚類分析圖

表4 19 種木瓜樣品的花粉聚類分析指標(biāo)

3 討論

花粉粒是種子植物雄蕊花粉囊內(nèi)的粉狀體［6］，其形態(tài)特征受植物基因型控制而不受外界環(huán)境的影響，具有極強(qiáng)的遺傳保守性，其花粉大小、形狀、表面雕紋及花粉壁結(jié)構(gòu)作為重要的孢粉學(xué)分析指標(biāo)比其他性狀更穩(wěn)定［7］，因此可以為植物系統(tǒng)分類學(xué)提供依據(jù)，是探討植物起源、演化及親緣關(guān)系的重要特征之一［8］。 目前公認(rèn)花粉是按照由大到小的順序進(jìn)化，即相對原始的被子植物花粉體積相對較大，其花粉粒大小的范圍為 50～99 μm［9］，有學(xué)者認(rèn)為花粉隨著植物由低等向高等的進(jìn)化，形態(tài)由球形轉(zhuǎn)變?yōu)槌L球形［10］。 本研究中 19 種木瓜的花粉均屬于 N3P4C3型，與前人研究結(jié)果具有一致性［8］。 且其花粉為超長球形或長球形，具有3 個(gè)萌發(fā)孔溝及條紋狀的表面紋飾，在被子植物中屬于進(jìn)化較成熟的種群。 雖然

木瓜屬各樣品花粉在外壁紋飾、萌發(fā)孔位置、形狀等方面的相似性表明其在屬的水平上具有統(tǒng)一性，但P、E、P/E 等差異性表明其在遺傳物質(zhì)上存在不同，同屬植物種間花粉形態(tài)特征的區(qū)別可作為區(qū)分植物的依據(jù)，因此對花粉微觀結(jié)構(gòu)的研究可為木瓜屬植物的分類與鑒定提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

在木瓜屬花粉性狀的聚類分析圖中，供試木瓜屬的19 個(gè)樣品被劃分為3 大類群，說明花粉性狀可作為分類輔助方法［10］，同時(shí)該結(jié)果也客觀反應(yīng)出該屬不同種之間的親緣關(guān)系。 因此木瓜孢粉學(xué)親緣關(guān)系可反映不同品種的分類地位，對揭示其親緣關(guān)系有重要意義；此為山東藥用木瓜植物資源的開發(fā)提供了依據(jù)。