李倩瑋，彭 然，王雨竹，劉道慶

（1.中國石油大學（北京）化學工程與環(huán)境學院，重質(zhì)油國家重點實驗室，北京 102249；2.北京大學環(huán)境科學與工程學院，北京 100871）

在循環(huán)冷卻水系統(tǒng)中，腐蝕、結(jié)垢和生物黏泥一般是同時存在的，生物黏泥還會對換熱設(shè)備的腐蝕和結(jié)垢產(chǎn)生影響〔1〕。微生物污垢廣泛存在于各種與水長期接觸的設(shè)備表面及內(nèi)部，微生物污垢是指微生物胞外產(chǎn)生的代謝物或黏液通過黏結(jié)無機物、灰塵、沙子等無機雜質(zhì)或生物殘骸形成的一層類似膜狀的淤泥態(tài)沉積物，并附著在固體表面〔2〕。工業(yè)循環(huán)冷卻水中能使管道內(nèi)壁產(chǎn)生污垢及引起金屬壁面腐蝕的微生物主要有鐵細菌、硫酸鹽還原菌和黏液細菌〔3-5〕。有研究表明，鐵細菌和硫酸鹽還原菌混合后會出現(xiàn)協(xié)同生長的現(xiàn)象，原因是鐵細菌有很強的微生物污染能力，而硫酸鹽還原菌對胞外聚合物（EPS）具有高分泌率〔6〕。

循環(huán)冷卻水系統(tǒng)中微生物的大量滋生與污垢沉積將會引發(fā)一系列問題，如使設(shè)備的換熱效率下降、能耗增加、維護管理費用增加、系統(tǒng)壽命縮短、系統(tǒng)運行成本提高等〔3，7-8〕。循環(huán)冷卻水系統(tǒng)中某些特異性細菌會分泌EPS，EPS是一種生物大分子聚合物質(zhì)，對生物膜的形成以及生物膜對不同重金屬離子的吸附起著非常重要的作用〔9〕。在成分構(gòu)成方面，EPS中的蛋白質(zhì)和多糖是決定微生物表面特性的關(guān)鍵物質(zhì)，約占有機物總量的70%～80%〔10〕，此外還有少量脂類、核酸、腐殖質(zhì)以及無機成分等，約占EPS總量的20%～30%〔11〕。在生物膜形成過程中，EPS主要參與微生物在金屬表面的附著過程，從而影響金屬表面生物膜的形成。關(guān)于微生物分泌的EPS對金屬表面的作用，有國內(nèi)外學者研究發(fā)現(xiàn)，微生物EPS能夠加速金屬腐蝕〔12〕，EPS與金屬表面的接觸可以改變腐蝕產(chǎn)物的化學性質(zhì)及其形態(tài)，使腐蝕產(chǎn)物具有更強的腐蝕性。

許多國內(nèi)學者對不同環(huán)境因素下微生物污垢的形成機制及影響因素進行了深入研究〔3-4，7〕。有學者發(fā)現(xiàn)微生物污垢的數(shù)量主要受Ca2+制約，其他金屬陽離子也具有一定的制約作用。在實際的工業(yè)冷卻水中，Ca2+的質(zhì)量濃度約為100～500 mg/L，已達到相當高的濃度。因此，Ca2+對微生物的生長過程以及在設(shè)備表面發(fā)生的微生物結(jié)垢過程的影響十分顯著〔13-14〕。

基于此，本研究擬通過提取循環(huán)冷卻水中優(yōu)勢菌種的EPS，借助現(xiàn)代儀器分析研究EPS與循環(huán)冷卻水中離子經(jīng)生化反應所形成的礦物，以及EPS在主要礦物表面的吸附行為，以期為減少微生物污垢腐蝕提供重要的理論和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

材料：二氧化硅（SiO2），阿拉丁試劑（上海）有限公司；氧化鐵（Fe2O3），上海麥克林生化科技有限公司；碳酸鈣（CaCO3），探索試劑平臺；BSA蛋白質(zhì)標準液、Bradford試劑，生工生物工程（上海）股份有限公司。

儀器：單功能光吸收全波長酶標儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；傅里葉變換紅外光譜分析儀（FT-IR），80v型，德國；X射線衍射儀（XRD），bruker D8 Advance型，德國；場發(fā)射掃描電子顯微鏡分析系統(tǒng)成分探測系統(tǒng)（SWM），GeminiSEM300型，德國；激光顯微拉曼光譜儀（Raman），Renishaw inVia plus型，英國；全自動石化水質(zhì)分析儀，LabRAM HR Evolution型，德國。

1.2 生物黏泥的培養(yǎng)

生物黏泥的培養(yǎng)采用靜態(tài)循環(huán)冷卻水模擬實驗方法，并進行對照培養(yǎng)實驗。循環(huán)冷卻水水樣取自北京某石化企業(yè)循環(huán)冷卻水系統(tǒng)。

對照組：在錐形瓶中加入500 mL循環(huán)水樣，將A3碳鋼掛片懸掛于錐形瓶中，使其充分浸泡于水中，將錐形瓶置于搖床中，在25℃、50 r/min的條件下培養(yǎng)。

實驗組：在錐形瓶中加入500 mL循環(huán)水樣，同時添加一定的營養(yǎng)物質(zhì)，將A3碳鋼掛片懸掛于錐形瓶中，使其充分浸泡于水中，將錐形瓶置于搖床中，在25℃、50 r/min的條件下培養(yǎng)微生物黏泥。同時，每隔24 h去除錐形瓶中80%的水，再添加補充水，補充水為添加了營養(yǎng)物質(zhì)的自來水。主要營養(yǎng)物質(zhì)包含碳源、氮源和磷源，實驗選用葡萄糖為微生物碳源（葡萄糖∶COD=1∶1.067）、硫酸銨為氮源、磷酸氫二鈉為磷源。補充水COD為150 mg/L、氨氮為10 mg/L、總磷為1 mg/L，滿足《工業(yè)循環(huán)冷卻水處理設(shè)計規(guī)范》（GB/T 50050—2017）要求。補充水的營養(yǎng)物水平為富營養(yǎng)水平，COD∶N∶P=150∶10∶1。

按上述高營養(yǎng)水平培養(yǎng)液及原水培養(yǎng)生物黏泥，每日測量高營養(yǎng)水平培養(yǎng)液及原水的pH，直至pH不再明顯變化，得出不同營養(yǎng)條件下生物黏泥達到穩(wěn)定附著期的所需時間，并通過高通量測序技術(shù)對比得出高營養(yǎng)水平培養(yǎng)條件下的優(yōu)勢菌種。將實驗組培養(yǎng)出的生物黏泥風干后研磨成粉末進行EDS及XRD檢測，分析礦化產(chǎn)物成分，選取其中3種特征礦物進行后續(xù)平衡吸附實驗。

1.3 生物黏泥中細菌EPS的制備

1.3.1 生物黏泥中細菌的培養(yǎng)

經(jīng)生物黏泥培養(yǎng)實驗可知，生物黏泥約在開始培養(yǎng)后7 d左右達到穩(wěn)定附著期，因此細菌富集培養(yǎng)時間選定7 d為1個周期。在無菌條件下，用灼燒后的接種環(huán)取少量碳鋼掛片上生長至穩(wěn)定附著期的黏泥，接種于300 mL LB液體培養(yǎng)基中，在25℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)7 d，直至細菌產(chǎn)生大量EPS并達到生長穩(wěn)定期。

1.3.2 細菌EPS的提取

將1.3.1章節(jié)培養(yǎng)得到的細菌與其分泌的EPS混合物分裝于50 mL離心管中，在4℃、6 000 r/min條件下離心15 min；收集上清液，經(jīng)4℃、12 000 r/min高速冷凍離心40 min去除細胞殘體；將高速冷凍離心后的上清液與3倍體積的無水乙醇混合均勻后，靜置于0～4℃冷藏48 h；待容器底部出現(xiàn)明顯沉淀且上清液基本保持澄清后，棄去上清液，將沉淀與少量剩余上清液的混合物再次高速冷凍離心，收集沉淀，即為EPS粗提取物。

1.3.3 EPS的純化

將EPS粗提取物用適量的超純水溶解，并轉(zhuǎn)移至透析袋（截流分子質(zhì)量3 500 u）中，用密封夾密封后，將透析袋完全浸沒在盛有超純水的燒杯中透析；超純水每天更換3次，去除乙醇等小分子雜質(zhì)；3 d后將透析液轉(zhuǎn)移到小玻璃燒杯中，凍干得到EPS純化樣品，密封后放置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?5〕。為確定成分組成，EPS冷凍干燥后的純化樣品采用激光顯微拉曼光譜儀進行分析，激光波長為532 nm，波數(shù)范圍為4 00～4 000 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.4 EPS在不同礦物表面的吸附實驗

1.4.1 EPS母液及礦物懸液的配制

將3種不同礦物成分（CaCO3、Fe2O3以及SiO2）分別放入研缽中研磨，過100目（0.150 mm）篩后，以10 mmol/L的NaCl溶液為背景電解質(zhì)，分別配制EPS母液和含不同礦物成分的礦物懸液，EPS母液質(zhì)量濃度為0.5 g/L，礦物懸液質(zhì)量濃度為1.25 g/L。用0.01 mol/L的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)EPS母液和礦物懸液的pH，使其與原水pH（pH=7.78）大致相同，平衡過夜。在50 mL離心管中，分別加入20 mL EPS母液與20 mL含不同礦物成分的礦物懸液，EPS的最終質(zhì)量濃度為0.25 g/L，礦物成分的最終質(zhì)量濃度為0.625 g/L。

1.4.2 EPS與礦物的平衡吸附實驗

將裝有不同礦物成分與EPS混合液的離心管在室溫為25℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min的條件下恒溫振蕩3 h至吸附平衡，再置于高速冷凍離心機中以4℃、11 000 r/min條 件 離 心40 min〔15〕。分 離 的 上 清 液 采用總有機碳分析儀測定TOC和TN，采用中性過硫酸鉀消解-紫外分光光度法測定TP，以表征EPS中多糖（EPS-C）、蛋白質(zhì)（EPS-N）和核酸（EPS-P）的含量。用原EPS中TOC、TN、TP減去平衡吸附離心后上清液中的殘留量，即得到EPS-C、EPS-N和EPS-P在不同礦物成分表面的吸附量。用XRD表征自然風干后的沉淀以確認EPS-礦物復合體的礦物組成，再用SEM觀察EPS與礦物的結(jié)合形態(tài)。

2 結(jié)果與討論

2.1 生物黏泥的EDS分析

生物黏泥包括鋼片上附著的黏泥及鋼片黏泥與循環(huán)冷卻水反應后形成的瓶底底泥。高營養(yǎng)條件下培養(yǎng)的生物黏泥的EDS結(jié)果見圖1。其中，（a）為鋼片上所掛黏泥；（b）為培養(yǎng)瓶瓶底黏泥。

圖1 平衡吸附前生物黏泥的EDS結(jié)果Fig.1 EDS results of biological slime before equilibrium adsorption

由圖1可知，鋼片黏泥中主要含有C、O、Fe、Si元素，底泥中主要含有C、O、Fe、Ca、Si元素。

2.2 生物黏泥的XRD分析

通過XRD確認高營養(yǎng)條件下培養(yǎng)的生物黏泥（鋼片黏泥與瓶底底泥的混合物）中的礦物組成，結(jié)果見圖2。

由黏泥的XRD譜圖（圖2）可知，生物黏泥中的礦物組成十分復雜，含有CaCO3礦物成分。結(jié)合EDS元素分析結(jié)果，最后選用實驗黏泥中所含礦物成分CaCO3及循環(huán)冷卻水中常見的2種礦物成分Fe2O3、SiO2〔13，16〕作為與EPS進行平衡吸附實驗的礦物。

圖2 生物黏泥XRD結(jié)果Fig.2 XRD results of biological slime

2.3 生物黏泥的微生物群落結(jié)構(gòu)分析

將原水與高營養(yǎng)條件培養(yǎng)的生物黏泥分別進行高通量生物測序檢測，得到原水與高營養(yǎng)循環(huán)冷卻水中細菌綱水平群落結(jié)構(gòu)組成圖，相對豐度不足1%的細菌均歸為Other，結(jié)果見圖3。其中，A為未添加營養(yǎng)物質(zhì)的原水培養(yǎng)水樣，B為高營養(yǎng)條件培養(yǎng)水樣，C為高營養(yǎng)條件培養(yǎng)的循環(huán)冷卻水中的微生物黏泥。

圖3 循環(huán)冷卻水中綱水平群落結(jié)構(gòu)組成Fig.3 Microbial community in circulating cooling water on class level

由綱水平群落結(jié)構(gòu)組成（圖3）可知，原水培養(yǎng)水樣中主要存在的微生物有α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，45.63%）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria，38.16%）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria，11.57%）、放線菌綱（Actinobacteria，4.35%）；而高營養(yǎng)條件下培養(yǎng)的水樣中主要存在的微生物有α-變形菌綱（67.59%）、放線菌綱（13.09%）、β-變形菌綱（11.78%）、γ-變形菌綱（4.17%）；高營養(yǎng)條件下培養(yǎng)的生物黏泥掛膜中主要存在的微生物與高營養(yǎng)水樣相同，分別為α-變形菌綱（59.60%）、β-變形菌綱（26.87%）、放線菌綱（8.07%）、γ-變形菌綱（2.34%）。由以上數(shù)據(jù)可知，變形菌門是循環(huán)冷卻水中最主要的優(yōu)勢菌〔17〕，α-變形菌綱無論在何種培養(yǎng)條件下都占據(jù)著優(yōu)勢地位，經(jīng)高營養(yǎng)條件培養(yǎng)后放線菌綱逐漸成為冷卻水中的優(yōu)勢菌。

2.4 拉曼光譜分析

凍干后的純化EPS的拉曼光譜見圖4。

圖4 EPS的拉曼光譜Fig.4 Raman of EPS

如圖4所示，2 830 cm-1處的振動峰對應蛋白質(zhì)、糖類中—CH2的反對稱伸縮振動，3 045 cm-1處的振動峰對應的是N-乙?；咸烟侵小狢H2的反對稱伸縮振動〔18〕。2 825～2 941 cm-1處的振動峰與蛋白質(zhì)和多糖有關(guān)。

2.5 EPS-礦物復合體的表面吸附量分析

EPS-C、EPS-N、EPS-P在3種 不 同 礦 物 成 分（CaCO3、Fe2O3、SiO2）表面的吸附量見表1。

表1 EPS-C、EPS-N、EPS-P在不同礦物表面的吸附量Table 1 Adsorption capacity of EPS-C，EPS-N and EPS-P on different mineral surfaces

由表1可知，在pH=7.78偏中性的酸堿度下，EPS-C和EPS-N在Fe2O3表面的吸附量要明顯高于SiO2，略高于CaCO3；但EPS-P則 更易吸附 在SiO2表面，其在SiO2表面的吸附量明顯高于CaCO3，略高于Fe2O3；即EPS中的多糖和蛋白質(zhì)更傾向于吸附在Fe2O3表面，核酸則更易吸附在SiO2表面。EPS-P在Fe2O3表面的吸附量要遠大于EPS-C和EPS-N在Fe2O3表面的吸附量，這可能是由于磷酸鹽基團與Fe2O3間會形成絡(luò)合物，促使EPS中磷酸化的大分子在赤鐵礦表面吸附，表明了含磷生物大分子在細菌黏附啟動中的關(guān)鍵作用〔15，19〕。

2.6 EPS-礦物復合體的SEM-EDS分析

吸附平衡后，EPS-礦物復合體的SEM結(jié)果見圖5。

圖5 EPS-CaCO3（a）、EPS-Fe2O3（b）和EPS-SiO2（c）的SEMFig.5 SEM of EPS-CaCO3（a），EPS-Fe2O3（b）and EPS-SiO2（c）

由圖5可知，EPS與礦物成分進行平衡吸附實驗后，有較為規(guī)則且圓潤的橢球體附著在礦物表面，其中CaCO3與SiO2由于礦物顆粒較大，可以清晰地觀察到橢球體附著在礦物較為平整的截面處；而Fe2O3粉末由于顆粒較小，僅能觀察到橢球體顆粒附著在Fe2O3顆粒的間隙。

因EPS-CaCO3復合體有明顯規(guī)則的橢球體顆粒附著在礦物較平整區(qū)域的表面，因此選擇其礦物平整表面和凸起的附著物進行EDS測定，其他復合體選取凸起處進行EDS測定，結(jié)果見圖6。

圖6 EPS-CaCO3、EPS-Fe2O3和EPS-SiO2的EDSFig.6 EDS of EPS-CaCO3，EPS-Fe2O3 and EPS-SiO2

根據(jù)EDS結(jié)果（圖6）可知，EPS-CaCO3復合體平面處主要含O、Ca、C元素，還含有微量的Si、Fe元素，即礦物平面處主要為CaCO3礦物成分〔圖6（a）〕；而凸起處的EDS結(jié)果與平面處并不完全相同，含有大量O元素，Ca元素含量少于O元素，此外還含有少部分C元素以及微量的Si、Fe元素〔圖6（b）〕，推測凸起處為生物材料，可能為EPS的橢球體，其與礦物成分的界限分明。EPS-Fe2O3復合體的主要元素為C、O、Fe〔圖6（c）〕，EPS-SiO2復合體主要元素為C、O、Si〔圖6（d）〕，說明EPS中的多糖成分可能分散在了礦物表面。

2.7 EPS-礦物復合體的XRD分析

利用XRD確認EPS與礦物吸附平衡后離心所得沉淀的礦物組成，結(jié)果見圖7。

圖7 EPS-礦物復合體XRD分析結(jié)果Fig.7 XRD analysis results of EPS-mineral compounds

由圖7可知，EPS與不同礦物結(jié)合后并沒有產(chǎn)生明顯的新礦物，僅僅是發(fā)生物理結(jié)合，即EPS在礦物表面的吸附為物理吸附。

3 結(jié)論

（1）高通量測序?qū)嶒灲Y(jié)果表明，循環(huán)冷卻水中的微生物在高營養(yǎng)條件下，α-變形菌綱占據(jù)著優(yōu)勢地位，放線菌綱也將逐漸成為優(yōu)勢菌。

（2）EPS與礦物的平衡吸附實驗表明，在與循環(huán)冷卻水pH大致相同的偏中性（pH=7.78）環(huán)境下，多糖組分和蛋白質(zhì)組分更易吸附在Fe2O3表面，但核酸組分更易吸附在SiO2表面。

（3）XRD、SEM和EDS分析結(jié)果表明，EPS與不同礦物成分吸附平衡后均未產(chǎn)生新的礦物，即EPS在礦物表面的吸附是物理吸附。

（4）循環(huán)冷卻水系統(tǒng)中優(yōu)勢菌種的EPS中主要含有的蛋白質(zhì)和多糖是決定微生物表面特性的關(guān)鍵物質(zhì)，且不同組分對沉積污垢中常含的3種礦物組分具有不同的吸附特性。據(jù)此，后續(xù)研究可以有針對性地去除更易使蛋白質(zhì)及多糖組分發(fā)生黏附的礦物組分及形成該礦物組分的離子，以減少微生物污垢的沉積及腐蝕。