王相安 張 勻 王慧銘

慢性盆腔炎為盆腔腹膜、生殖器及周圍組織發(fā)生的炎癥反應，臨床上西醫(yī)治療多以抗生素為主，由于病灶多位于盆腔組織深部，抗生素難以獲得較高血藥濃度，且長期使用抗生素易造成耐藥性及菌群失衡[1]。該病屬中醫(yī)“婦人腹痛”“癥瘕”“帶下病”等范疇，主要是經(jīng)期產(chǎn)后，不慎房事或感染外邪，濕熱之邪浸注下焦，留注沖任、胞宮而至，治療當以活血化瘀、清熱利濕、理氣止痛、通經(jīng)活絡為主[2]。裘氏二藤湯出自全國首批名老中醫(yī)藥專家學術經(jīng)驗繼承工作指導老師、國家級名老中醫(yī)裘笑梅教授，由忍冬藤、大血藤、赤芍、川楝子、丹參、延胡索、大黃、大青葉、甘草、牡丹皮、蒲公英這11 味中藥材組成，廣泛應用于盆腔炎癥性疾病，并取得良好的臨床療效[3]。本研究基于網(wǎng)絡藥理學對二藤湯的主要活性成分、作用靶點、基因通路等方面進行分析，通過分子對接方法驗證活性成分與靶點的結合能力。

1 資料與方法

1.1 二藤湯的活性成分及作用靶點的篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）[4]及中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medicine Integrative Database，TCMID）[5]檢索二藤湯中11 味藥物的活性成分，設定口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 為篩選條件，進行活性成分的篩選，以獲得二藤湯的主要活性成分。將收集的主要活性成分輸入TCMSP 數(shù)據(jù)庫中，檢索主要活性成分的潛在靶點并去除沒有檢索到靶點的活性成分。同時，利用UniProt 數(shù)據(jù)庫[6]，限定物種為“homo sapiens”，校準主要活性成分對應靶點的基因信息，得到標準化的靶點名稱。

1.2 “中藥-活性成分-藥物靶點”網(wǎng)絡的構建 利用篩選出的活性成分和靶基因在Cytoscape3.7.2 軟件上繪制二藤湯-活性成分-靶基因網(wǎng)絡，運行Network Analyzer 插件進行拓撲分析，根據(jù)degree 值大小篩選出核心成分。

1.3 慢性盆腔炎相關靶點的篩選 利用Genecards數(shù)據(jù)庫（相關性評分即Score 值≥1.0）[7]和OMIM 數(shù)據(jù)庫[8]，以“Chronic Pelvic Inflammatory Disease”作為檢索詞分別檢索慢性盆腔炎潛在靶點，合并去除重復基因后，最終獲得與慢性盆腔炎相關的作用靶點。

1.4 藥物-疾病共同靶點的篩選 將二藤湯活性成分作用靶點與慢性盆腔炎相關靶點取交集，并利用Venny 2.1.0 在線軟件繪制Venn 圖，得到藥物-疾病共同的靶基因。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡的構建 將“1.4”獲得的交集靶點導入STRING 11.5 數(shù)據(jù)庫中[9]，限定物種為“homo sapiens”，并以置信度≥0.4 為條件篩選，獲取蛋白相互作用關系，導出TSV 格式文件，并導入Cytosape 3.7.2 軟件中，運行CytoNCA 插件進行拓撲分析并根據(jù)degree值篩選出核心靶基因。

1.6 通路和功能富集的分析 將“1.4”獲得的交集靶點導入Metascape 平臺[10]，將生物種類設定為“homo sapiens”，根據(jù)P<0.01，進行GO（gene ontology）富集分析與KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）通路分析，并利用R 語言對結果進行可視化處理。

1.7 分子對接驗證 在PubChem 數(shù)據(jù)庫[11]獲得核心活性成分的2D 結構，并導入Chem3D 軟件得到優(yōu)化后的3D 結構。在PDB 數(shù)據(jù)庫尋找靶蛋白的3D 結構，運用PYMOL 2.3.0 對靶蛋白進行去水分子及去配體等操作，同時利用AutoDock 4.2.6 軟件對靶蛋白進行加氫，最后，利用AutoDock Vina 1.1.2 軟件將受體蛋白與配體小分子進行分子對接并用PYMOL 2.3.0 進行可視化。

2 結果

2.1 二藤湯的活性成分和作用靶點收集 設定OB≥30%且DL≥0.18 及剔除沒有相應靶點的活性成分后，從TCMSP、TCMID 共獲取231 種活性成分，其中赤芍9 種，川楝子5 種，大黃8 種，大青葉6 種，大血藤1 種，丹參56 種，甘草80 種，牡丹皮1 種，蒲公英2 種，忍冬藤2 種，延胡索46 種，15 種各藥物間共同的活性成分，利用UniProt 數(shù)據(jù)庫校準所有靶點名稱，去除重復及無效值后共得到308 個靶點。為方便后續(xù)研究，按藥物的首字母縮寫進行編碼，其中赤芍活性成分被標記為CS1-CS9，以此類推，川楝子、大黃、大青葉、大血藤、丹參、甘草、牡丹皮、蒲公英、忍冬藤、延胡索各自的活性成分被標記為CLZ1-CLZ5、DH1 -DH8、DQY1 -DQY6、DXT1、DS1 -DS56、GC1-GC80、MDP1、PGY1-PGY2、RDT1-RDT2、YHS1-YHS46。15 種共同的活性成分被標記為A1-O1。

2.2 “中藥-活性成分-藥物靶點”網(wǎng)絡的構建 通過Cytoscape3.7.2 繪制中藥-成分-靶點網(wǎng)絡，網(wǎng)絡總共包括550 個節(jié)點（11 個藥材節(jié)點、231 個活性成分節(jié)點、308 個靶點節(jié)點）和5373 條邊，見圖1。通過內置的Network Analyzer 分析該網(wǎng)絡拓撲學參數(shù)，并根據(jù)degree 值大小選取排名前15 的核心成分，見表1。

表1 二藤湯的核心活性成分信息

2.3 慢性盆腔炎靶點的收集與韋恩圖的構建 利用GeneCards 數(shù)據(jù)（Relevance score≥1.0）庫和OMIM數(shù)據(jù)庫，以“Chronic Pelvic Inflammatory Disease”為關鍵詞，檢索慢性盆腔炎的靶點，并將兩個數(shù)據(jù)庫得到的靶點合并刪除重復值后,共得到4835 個靶點，與二藤湯相關的308 個靶點同時導入Venny 2.1.0 在線軟件進行交集分析并繪制Venn 圖，共獲得211 個交集靶點，即為二藤湯治療慢性盆腔炎的潛在作用靶點。見圖2。

2.4 PPI 網(wǎng)絡的構建 將二藤湯與慢性盆腔炎的211 個共同靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫，限定物種“Homo sapiens”，設置置信度≥0.4，獲取蛋白相互作用關系圖及TSV 格式文件，見圖3。將TSV 格式文件導入Cytoscape3.7.2 軟件中，運行CytoNCA 插件對共有靶點進行拓撲分析，并根據(jù)degree 值大小篩選前20位關鍵靶點，進行網(wǎng)絡構建得到關鍵靶點PPI 網(wǎng)絡圖，見圖4。同時根據(jù)度值的大小進行排列，得到PPI網(wǎng)絡中核心靶點柱狀圖，見圖5。

2.5 GO 功能和KEGG 通路富集分析

2.5.1 GO 功能富集分析 利用Metascape 平臺，設置P<0.01 作為篩選條件，將交集靶點進行GO 的生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組分（cellular component，CC）分析，總共富集到2538 個條目，其中2174 項BP，233項MF，131 項CC，根據(jù)富集顯著程度篩選出排名前10 的條目，并利用R 語言繪制柱狀圖，見圖6。其中，BP 主要涉及細胞對脂質及氮化合物的反應，外來刺激的反應等；CC 主要涉及等細胞質膜、激素受體復合物等；MF 主要涉及等DNA 結合轉錄因子、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA 結合轉錄因子等。

2.5.2 KEGG 通路富集分析 利用Metascape 平臺，設置P<0.01 作為篩選條件，將交集靶點進行KEGG分析，共得到209 條信號通路，根據(jù)富集顯著程度篩選出排名前20 條目，并利用R 語言繪氣泡圖，見圖7。主要涉及糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAGE 信號通路、雌激素信號、MAPK、AMPK 等信號通路,同時，為了進一步探索排名前10 種活性成分及其靶點在疾病通路中發(fā)揮的作用，運用Cytoscape 3.7.2 構建“活性成分-靶點-通路”網(wǎng)絡，見圖8。

2.6 分子對接結果 使用AutoDock Vina 1.1.2 軟件對排名前8 位的關鍵靶點和活性成分進行分子對接（見表2）。結合能值越低，二者的結合效果越好，通常以結合能≤-5.0 kJ/mol 作為標準。結果顯示，各靶點和活性成分之間對接的最低結合能結果均小于-5.0 kJ/mol，說明活性成分與受體蛋白具有較好的結合活性，進一步驗證了上述網(wǎng)絡藥理學的結果。其中，活性成分與AKT1 及CASP3 對接后的平均結合能最小，故選取與AKT1 及CASPS 的對接結果并用PYMOL 2.3.0 展示，見圖9。

表2 核心活性成分和核心靶蛋白的結合能（kcal/mol）

3 討論

本研究通過“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡篩選出核心活性成分主要為槲皮素、木犀草素、山奈酚等。槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，具有減少炎癥細胞因子分泌、抗氧化、清除自由基等藥理作用[12]，槲皮素通過調節(jié)分子伴侶HSC70 負向控制MNSFβ 從而抑制脂多糖（LPS）誘導的巨噬細胞釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥因子[13]。木犀草素通常以糖基化形式存在于各種藥材及食物中,動物實驗表明，木犀草素通過調控小鼠骨髓來源的巨噬細胞的極性而抑制炎癥反應[14]。山奈酚可以通過對Dectin-1 和p38 MAPK 通路的抑制，下調白介素-1β（IL-1β）、TNF-α等炎癥因子的表達[15]。因此，筆者推測二藤湯的關鍵活性成分主要通過抗炎機制作用于慢性盆腔炎。

PPI網(wǎng)絡分析表明，AKT1、TNF、IL6、ESR1 及PTGS2 等均具有較高的度值，可能是二藤湯發(fā)揮抗慢性盆腔炎作用的關鍵靶點。AKT1、TNF、IL6 均參與免疫及炎癥反應。細菌感染后炎癥因子迅速升高，促進炎癥細胞激活，引起盆腔周圍結締組織發(fā)生充血、水腫，逐漸演變成慢性盆腔炎[16]。PTGS2 又稱環(huán)氧化酶-2（COX-2），是一種前列腺素生成的合成酶，在促炎細胞因子、生長因子等誘導下，參與炎癥反應、細胞增殖及凋亡等多種病理過程，ESR1 編碼雌激素受體，當與雌激素結合，釋放致痛物質，導致慢性盆腔痛的發(fā)生[17]。

KEGG 通路分析顯示藥物作用靶點主要富集于MAPK、AMPK 及GE-RAGE 信號等于炎癥及疼痛相關的通路。其中，AMPK 信號通路激活可以抑制LPS誘導的巨噬細胞M1 型極化，減少TNF-α、IL-6 等炎癥因子的釋放，從而抑制炎癥反應[18]。MAPK 信號通路與細胞增殖、凋亡及炎癥反應密切相關，研究表明，通過抑制miR-21 的表達進而抑制MAPK 信號通路的活化，可以起到抗炎及止痛作用[19]。AGERAGE 信號通路在糖尿病及其并發(fā)癥的形成與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，AGEs 可以激活RAGE，會引起全身性炎癥反應和氧化損傷[20]。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接初步預測裘氏二藤湯多成分、多靶點、多信號通路治療慢性盆腔炎的分子機制，符合中醫(yī)“整體觀”理論。本研究存在一定局限性，由于公共數(shù)據(jù)庫是實時更新的，所以本研究結果只在一定程度上揭示二藤湯抗慢性盆腔炎的作用機制，后續(xù)有必要進行細胞或動物實驗加以驗證。