盛 濤 馬天紅 嚴(yán)禮劍 邵 歡 王曉庭 赫艷梅
慢性前列腺炎是常見(jiàn)的男性泌尿系統(tǒng)疾病,影響患者生活質(zhì)量。土茯苓味甘、淡,性平,有解毒、除濕、通利關(guān)節(jié)之功效,主要用于筋骨疼痛、濕熱淋濁、帶下、癰腫、瘰疬、疥癬[1]。研究表明,土茯苓具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、改善微循環(huán)等作用[2]。慢性前列腺炎在中醫(yī)屬“精濁”范疇,其病機(jī)主要為濕熱、腎虛、瘀血[3]。臨床觀察表明,濕熱瘀阻型慢性前列腺炎最為多見(jiàn)[4]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SD 大鼠前列腺組織IL-1β、IL-6 和TNF-α 濃度,結(jié)合前列腺組織的病理學(xué),探討土茯苓總黃酮對(duì)自身免疫性前列腺炎模型大鼠的干預(yù)作用及機(jī)制。
1.1 動(dòng) 物 8 周齡雄性SD 大鼠60 只,SPF 級(jí),體質(zhì)量200~220 g[上海斯萊克,SCXK(滬)2013-0016];飼養(yǎng)環(huán)境:浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心[SYXK(浙)2018-0012];溫度(22±2)℃,濕度50%~60%,采用12 h 晝夜節(jié)律,自由飲水與進(jìn)食下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周,實(shí)驗(yàn)完全遵照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的倫理要求進(jìn)行。
1.2 藥 物 土茯苓(浙江國(guó)藥有限公司,批號(hào)20190049);土茯苓總黃酮對(duì)照品(武漢中標(biāo)科技有限公司,批號(hào)CFN98643);阿司匹林片(丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限公司,批號(hào)20190501);百白破疫苗(成都生物制品研究所,批號(hào)S10970019)。
1.3 試 劑 Mouse IL-1beta Platinum Elisa(美國(guó)eBioscience 公司,批號(hào)147435043),Mouse IL-6 Platinum Elisa(美國(guó)eBioscience 公司,批號(hào)145466066),Mouse TNF-alpha Platinum Elisa(美國(guó)eBioscience公司,批號(hào)147819025)。10%甲醛(蘇州市三杰化學(xué)品科技有限公司,批號(hào)20160418);曙紅Y 生物染色劑(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20140909);無(wú)水蘇木色精(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20171A);水為超純水,乙腈、甲醇為色譜純,其余試劑為分析純。
1.4 主要儀器 MR-4100 酶標(biāo)儀(美國(guó)Dynatech 公司);D-37520 高速低溫離心機(jī)(賽默飛世爾科技公司);ASP300S 全自動(dòng)組織脫水機(jī)(Leica 公司);RM2235 石蠟切片機(jī)(Leica 公司);DM3000 LED 顯微鏡(Leica 公司);BT125d 電子天平(Sartorius 公司)。
2.1 供試藥物制備 土茯苓總黃酮由本實(shí)驗(yàn)室提取[5]。取土茯苓飲片粉碎后過(guò)篩,75%乙醇溶劑浸泡30 min,采用300 W/55 kHz 超聲波輔助提取20 min,提取液旋蒸后冷凍干燥,得到土茯苓提物。采用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定土茯苓提物中總黃酮(TFSG)成分含量[1]。
2.2 造模與分組 采用純化前列腺蛋白刺激法制備大鼠自身免疫性前列腺炎模型[6],SD 大鼠60 只,經(jīng)過(guò)7 d 適應(yīng)性喂養(yǎng)后按照隨機(jī)數(shù)字表法分成空白組、模型組、阿司匹林組、土茯苓總黃酮低、中、高劑量組,每組10 只。將大鼠麻醉后,腹腔注射百白破疫苗0.5 mL,皮下多點(diǎn)注射前列腺蛋白提純稀釋液與完全弗氏佐劑(FCA)混合乳劑(1∶1 體積)1 mL。30 d 后,重復(fù)1 次,即可誘導(dǎo)產(chǎn)生大鼠自身免疫性前列腺炎癥,對(duì)照組注射等體積生理鹽水。造模成功后按劑量低中高組分別灌胃100、300 及500 mg/kg 的土茯苓總黃酮,空白組、模型組給予相同體積生理鹽水,阿司匹林組給予100 mg/kg 阿司匹林混懸液[7],每天1次,連續(xù)給藥15 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后于末次灌胃2 h 后脫頸處死大鼠,解剖分離大鼠前列腺組織為測(cè)定樣本。
2.3 ELISA 法測(cè)定前列腺組織勻漿IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平 取樣本前列腺組織,加入0.5 mL 預(yù)冷的生理鹽水,組織均漿儀均漿,置于1.5 mL EP 離心管中,2000 r/min 低溫離心15 min 后移液槍收集上清液。分別按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定其IL-1β、IL-6、TNF-α 的ELISA 濃度,以計(jì)算大鼠前列腺炎性因子生成抑制率。炎性因子生成抑制率=(模型組炎性細(xì)胞因子表達(dá)-阿司匹林組炎性細(xì)胞因子表達(dá))/模型組炎性細(xì)胞因子表達(dá)×100%。
2.4 HE 染色檢測(cè)大鼠前列腺組織病理學(xué) 大鼠前列腺組織10%甲醛溶液固定72 h 后石蠟包埋,切片(厚度4 μm),HE 染色后觀察病理變化,以評(píng)估前列腺炎癥情況。
2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0 軟件處理數(shù)據(jù);數(shù)據(jù)分析采用回歸/擬合計(jì)算軟件處理,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示;多組間比較使用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行檢驗(yàn),兩兩比較采用SNK 檢驗(yàn)方法,P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.1 土茯苓總黃酮對(duì)前列腺組織勻漿IL-1β、IL-6和TNF-α 水平的影響 與空白組比較,各實(shí)驗(yàn)組大鼠前列腺組織IL-1β 水平明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均<0.05);土茯苓總黃酮低劑量組和模型組IL-6 水平明顯高于空白組(P<0.05);土茯苓總黃酮低劑量組及模型組間比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);阿司匹林組與空白組TNF-α 水平相近(P>0.05),其余四組TNF-α 水平均高于空白組(P 均<0.05);與模型組比較,除土茯苓總黃酮低劑量組外,其余各實(shí)驗(yàn)組IL-1β、IL-6、TNF-α 水平明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均<0.05);土茯苓總黃酮高劑量組IL-6 水平與阿司匹林組相近(P>0.05)。土茯苓總黃酮低、中、高劑量組間IL-1β、IL-6、TNF-α 水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。
表1 各組大鼠前列腺組織勻漿IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平比較(ng/L,)
表1 各組大鼠前列腺組織勻漿IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平比較(ng/L,)
注:空白組和模型組予生理鹽水灌胃;土茯苓總黃酮低、中、高劑量組分別予100、300 及500 mg/kg 的土茯苓總黃酮溶液灌胃;阿司匹林組給予100 mg/kg 阿司匹林溶液灌胃;IL-1β 為白細(xì)胞介素1β;IL-6 為白細(xì)胞介素6;TNF-α 為腫瘤壞死因子α;與空白組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05;與總黃酮中劑量組比較,cP<0.05;與總黃酮高劑量組比較,dP<0.05
3.2 土茯苓總黃酮對(duì)模型大鼠前列腺形態(tài)組織學(xué)影響 空白組大鼠前列腺其腺腔結(jié)構(gòu)完整,腺泡上皮細(xì)胞一般為單層柱狀或立方狀上皮,腺腔形態(tài)不一,無(wú)或少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及水腫。模型組大鼠前列腺存在部分腺腔萎縮,基底膜破壞嚴(yán)重,腺上皮多為扁平狀,腺腔內(nèi)分泌物顯著減少,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及水腫,可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞。阿司匹林及土茯苓高劑量組鏡下表現(xiàn)相近,其前列腺組織趨于正常,前列腺腺腔結(jié)構(gòu)完整,腺泡上皮可見(jiàn)少量增生,存在少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),偶見(jiàn)成纖維細(xì)胞。土茯苓中劑量組大鼠前列腺腺體組織少部分腺腔萎縮,少部分基底膜被破壞,少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),可見(jiàn)少量成纖維細(xì)胞。土茯苓低劑量組大鼠前列腺組織部分腺腔萎縮,基底膜部分破壞,較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及纖維組織增生。見(jiàn)圖1。
研究表明,炎癥因子在自身免疫性前列腺炎的病理機(jī)制中起到非常關(guān)鍵的作用[8];其中,IL-1β 和TNF-α 是自身免疫性前列腺炎的病理發(fā)展過(guò)程中的重要促炎因子,而IL-6 則能夠調(diào)節(jié)IL-2 及IL-1β和TNF-α 的合成[9]。
一般認(rèn)為,IL-1β 作為最經(jīng)典的炎癥調(diào)節(jié)劑,是炎癥調(diào)節(jié)的始動(dòng)因素[10]。本實(shí)驗(yàn)?zāi)P徒M大鼠前列腺組織IL-1β 表達(dá)明顯上調(diào),土茯苓總黃酮各組及阿司匹林組前列腺組織IL-1β 表達(dá)存在不同程度的下降。這進(jìn)一步證明了自身免疫性前列腺炎造模行為激活了炎性反應(yīng)的發(fā)生,使IL-1β 表達(dá)上調(diào),從而促使前列腺組織炎癥進(jìn)展。IL-6 在自身免疫性前列腺炎的炎癥進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用,慢性前列腺炎前列腺腺體組織IL-6 表達(dá)明顯升高[9]。本實(shí)驗(yàn)中,模型組前列腺組織IL-6 的明顯升高,表明土茯苓總黃酮高劑量組及中劑量組對(duì)前列腺組織IL-6有不同程度的抑制作用,其中,土茯苓總黃酮高劑量組與阿司匹林組的抑制水平接近。
研究證明,TNF-α 等炎癥因子在身免疫性前列腺炎患者體內(nèi)呈現(xiàn)過(guò)高的表達(dá)[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),模型組大鼠前列腺組織TNF-α 明顯上升,土茯苓總黃酮低、中、高劑量組及阿司匹林組TNF-α 表達(dá)均明顯下降(P 均<0.05),表現(xiàn)為相對(duì)較低的TNF-α 水平。表明土茯苓總黃酮能明顯降低TNF-α 表達(dá)。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,土茯苓總黃酮能降低自身免疫性前列腺炎模型大鼠前列腺組織IL-1β、IL-6 及TNF-α 表達(dá)水平,改善前列腺病理形態(tài),從而減輕前列腺組織的炎癥反應(yīng)。