董曉敏 王朝南 林瑞芳 林雅靜
骨質(zhì)疏松癥是因骨代謝平衡失調(diào)導(dǎo)致的以骨強(qiáng)度降低、骨折風(fēng)險(xiǎn)增加為特征的骨骼系統(tǒng)疾病,表現(xiàn)為骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞,進(jìn)而引起骨脆性增加,容易發(fā)生骨折[1]。骨質(zhì)疏松癥相關(guān)性疾病的發(fā)病率、致殘率和病死率在老年患者中逐年增加,尤其是絕經(jīng)后婦女罹患骨質(zhì)疏松癥遠(yuǎn)大于男性,主要與雌激素缺乏相關(guān),通過(guò)積極治療延緩骨量減少速度,可顯著減低骨折發(fā)生,對(duì)已發(fā)生骨折的患者也可有效防止再次發(fā)生骨折。阿魏酸是一種酚酸類(lèi)成分,是抗骨質(zhì)疏松癥常用中藥當(dāng)歸、川芎的有效成分之一。除抗氧化作用外,研究表明,阿魏酸還能通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡基因,從而發(fā)揮抗成骨細(xì)胞凋亡的作用[2]。阿魏酸可刺激體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化,促進(jìn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)[3]。本研究通過(guò)觀察阿魏酸對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨微結(jié)構(gòu)和骨代謝的影響,探討其防治骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取2 月齡Wistar 雌性大鼠40只,體質(zhì)量為(225±25)g,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)中,所有大鼠自由進(jìn)食和飲水,使用標(biāo)準(zhǔn)飼料,其中鈣含量為1%,磷含量0.8%,70%~80%碳水化合物和5%脂肪。飼養(yǎng)環(huán)境溫度25 ℃,相對(duì)濕度50%~70%,12 h 晝夜循環(huán)周期。本研究得到溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)wydw2021-0580)。
1.2 試劑和儀器 阿魏酸(上海源葉生物科技有限公司,批號(hào)B20007)、堿性磷酸酶(ALP)(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào)ml003360)、骨鈣素酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司,批號(hào)ml002883)。雙能X 線骨密度儀(美國(guó)Hologic 公司,型號(hào):Discovery Wi)、Micro-CT(德國(guó)BRUKER 公司,型號(hào):Skycan1276)、LEICA RM2235切片機(jī)(德國(guó)LEICA 公司,型號(hào):RM2235)、生物顯微鏡(德國(guó)Zeiss 公司,型號(hào):Axio Lab.A1)。
1.3 分組和模型制備 所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,40 只Wistar 雌性大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、阿魏酸低劑量組和阿魏酸高劑量組,每組10 只。使用1%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉所有大鼠,在左右軟肋下剪開(kāi)皮膚,分離筋膜,顯露腹腔,找到雙側(cè)卵巢及周?chē)M織,其中假手術(shù)組僅切除卵巢周?chē)窘M織(卵巢大?。P徒M、阿魏酸低劑量組和阿魏酸高劑量組切除雙側(cè)卵巢組織建立骨質(zhì)疏松模型。手術(shù)結(jié)束時(shí)所有大鼠均給予青霉素預(yù)防感染,過(guò)程順利,無(wú)大鼠死亡。術(shù)后所有大鼠連續(xù)3 d 肌注青霉素鈉預(yù)防感染(每天20 萬(wàn)U)。術(shù)后1 周,待大鼠狀態(tài)恢復(fù)后,開(kāi)始喂養(yǎng)干預(yù)。假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水[50 mL/(kg·d)]灌胃,阿魏酸低劑量組和阿魏酸高劑量組分別給予等量阿魏酸[20、80 mg/(kg·d)]灌胃,藥物劑量參考文獻(xiàn)[4],研究顯示該劑量可改善骨質(zhì)高轉(zhuǎn)換狀態(tài)。每天上午灌胃1 次,連續(xù)12 周。
1.4 檢測(cè)指標(biāo) 治療結(jié)束時(shí)用適量水合氯醛麻醉處死大鼠,經(jīng)下腔靜脈采血,4 ℃離心分離制備血清,使用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血鈣、血磷濃度,按照ALP 及骨鈣素ELISA 試劑盒說(shuō)明測(cè)定ALP 和骨鈣素(OC)水平。獲取各組大鼠雙側(cè)股骨,剔除肌肉等結(jié)締組織,對(duì)右側(cè)股骨采用骨密度儀及Micro-CT 測(cè)定骨密度和骨微結(jié)構(gòu)參數(shù),包括皮質(zhì)骨骨小梁體積比率(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁間隙(Tb.Sp)。各組大鼠左側(cè)股骨取10%甲醛固定液固定24 h,轉(zhuǎn)75%乙醇脫水過(guò)夜,常規(guī)石蠟包埋,制作病理學(xué)切片,片厚3 μm,HE 染色,生物顯微鏡下觀察股骨HE 染色情況及骨小梁形態(tài)。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間樣本比較采用單因素方差分析(oneway ANOVA)分析,兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn),以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 阿魏酸對(duì)大鼠血清骨代謝指標(biāo)的影響 給藥12 周后,與模型組比較,阿魏酸低、高劑量組大鼠血清鈣、磷濃度和ALP 含量均無(wú)明顯差異(P>0.05),阿魏酸低、高劑量組大鼠OC 含量有所下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表1。
表1 各組大鼠骨代謝指標(biāo)比較()
表1 各組大鼠骨代謝指標(biāo)比較()
注:假手術(shù)組為僅切除卵巢周?chē)荆辞谐殉?;模型組為手術(shù)切除雙側(cè)卵巢,等量生理鹽水灌胃;阿魏酸低劑量組為手術(shù)切除雙側(cè)卵巢,給予阿魏酸20 mg/(kg·d)灌胃;阿魏酸高劑量組為手術(shù)切除雙側(cè)卵巢,給予阿魏酸80 mg/(kg·d)灌胃;ALP 為堿性磷酸酶;OC 為骨鈣素;與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05
2.2 阿魏酸對(duì)大鼠股骨骨小梁的影響 在股骨骨微結(jié)構(gòu)測(cè)定上,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠骨密度、BV/TV、Tb.Th 以及Tb.N 都有不程度下降,而Tb.Sp增大(P<0.05);與模型組比較,阿魏酸低、高劑量組骨密度、BV/TV、Tb.Th 以及Tb.N 均有明顯回升,而Tb.Sp 變?。≒<0.05),見(jiàn)表2。
表2 各組大鼠股骨近端骨骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較()
表2 各組大鼠股骨近端骨骨微結(jié)構(gòu)指標(biāo)比較()
注:假手術(shù)組為僅切除卵巢周?chē)?,未切除卵巢;模型組為手術(shù)切除雙側(cè)卵巢,等量生理鹽水灌胃;低劑量組為手術(shù)切除雙側(cè)卵巢,給予阿魏酸20 mg/(kg·d)灌胃;高劑量組為手術(shù)切除雙側(cè)卵巢,給予阿魏酸80 mg/(kg·d)灌胃;BMD 為骨密度;BV/TV 為骨小梁體積比率;Tb.Th 為骨小梁厚度;Tb.N 為骨小梁數(shù)目;Tb.Sp 為骨小梁間隙;與假手術(shù)組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05
2.3 股骨組織切片觀察 股骨干骺端HE 染色如下圖顯示,與假手術(shù)組比較,模型組切除雙側(cè)卵巢后,大鼠股骨骨松質(zhì)骨小梁排列變薄稀疏,髓腔增大;與模型組比較,阿魏酸組組織切片顯示骨皮質(zhì)增厚且連續(xù),骨小梁相對(duì)體積變大,數(shù)量增多,表明骨結(jié)構(gòu)有所恢復(fù)。見(jiàn)圖1。
絕經(jīng)后女性由于雌激素的缺乏,造成骨吸收和骨成形的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào),導(dǎo)致骨成形率低于骨吸收率,進(jìn)而使得體內(nèi)骨量減少和骨強(qiáng)度逐漸下降[5]。中藥治療骨質(zhì)疏松,在有效改善骨量的同時(shí),能明顯減少相關(guān)不良反應(yīng)的發(fā)生[6]。研究表明,去勢(shì)大鼠模型的雌激素、骨骼變化和絕經(jīng)后婦女改變相似[7],故本研究通過(guò)去勢(shì)大鼠建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型來(lái)研究阿魏酸抗骨質(zhì)疏松的作用。
研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激會(huì)抑制成骨細(xì)胞分化,增加破骨細(xì)胞的分化的吸收功能[8],被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制中重要原因[9]。眾所周知,阿魏酸被認(rèn)為具有抗炎抗氧化等多種生物作用[10]。在誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子通路傳導(dǎo)時(shí),阿魏酸同時(shí)會(huì)促進(jìn)β-連環(huán)蛋白在間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá),此過(guò)程可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨,增加ALP 和OC 的含量[11],同時(shí)促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)骨保護(hù)素mRNA 和骨活素mRNA,誘導(dǎo)生成鈣化結(jié)節(jié),進(jìn)而促進(jìn)成骨形成。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),阿魏酸40~640 μmol/L 濃度時(shí)可以促進(jìn)骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)形成,在40~2560 μmol/L 濃度時(shí)會(huì)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化功能[3]。ALP 是成骨細(xì)胞分化早期特異性標(biāo)志之一,而骨鈣素不僅是成骨細(xì)胞活性標(biāo)志[12],還能反映骨轉(zhuǎn)化狀態(tài),即血清骨鈣素水平會(huì)隨著骨轉(zhuǎn)化增強(qiáng)而升高[13]。在實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過(guò)去卵巢處理,缺乏雌激素的模型組和阿魏酸組大鼠血清ALP 和OC 濃度都高于假手術(shù)組,同時(shí)由于阿魏酸低、高劑量組均能抑制骨轉(zhuǎn)化過(guò)程中血清OC 水平的升高,實(shí)驗(yàn)中測(cè)定OC 含量均低于模型組(P<0.05),這也反映阿魏酸具有增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性、促進(jìn)增殖分化的作用。此外,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)雌激素受體亞型GPR30 對(duì)骨保護(hù)有重要作用[14],阿魏酸等中藥的相關(guān)活性成分可通過(guò)特異性激活GPR3O 通路促進(jìn)骨生長(zhǎng),還能避免傳統(tǒng)雌激素替代治療引起子宮內(nèi)膜增厚等副作用[2]。目前已知破骨細(xì)胞是體內(nèi)唯一具有骨吸收能力的細(xì)胞,在骨代謝中破骨細(xì)胞的數(shù)量和活性與骨質(zhì)疏松癥的形成密切相關(guān)[15]。
研究表明,核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路是介導(dǎo)骨吸收和骨成形之間平衡的重要通路[16],其中NFκB 是成熟破骨細(xì)胞存活和發(fā)揮作用的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[17]。阿魏酸通過(guò)下調(diào)核因子κB 受體活化因子配體(RANKL)誘導(dǎo)的NF-κB 活化水平,抑制RANKL 誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化,從而減少破骨細(xì)胞的生成,并使破骨細(xì)胞的骨吸收活性下降[18]。研究表明,通過(guò)Micro-CT 觀察骨微結(jié)構(gòu)能較靈敏反映骨質(zhì)疏松癥的早期表現(xiàn)[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,通過(guò)去勢(shì)干預(yù),模型組大鼠股骨骨小梁排列稀疏變薄,髓腔變大,而阿魏酸組的大鼠骨皮質(zhì)增厚且連續(xù),皮質(zhì)骨量增加,松質(zhì)骨網(wǎng)結(jié)構(gòu)致密,且骨量增加與阿魏酸劑量成正相關(guān),大鼠BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th 較模型組顯著增加,Tb.Sp呈下降趨勢(shì)(P<0.05),表明阿魏酸在合適濃度范圍內(nèi)可以防止骨質(zhì)流失,增加骨礦沉積,糾正雌激素缺乏的骨代謝失衡,改善去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥的骨微結(jié)構(gòu),這對(duì)預(yù)防骨質(zhì)疏松有重要作用。
總之,本研究結(jié)果表明,阿魏酸對(duì)去勢(shì)大鼠骨微結(jié)構(gòu)有一定改善作用,可促進(jìn)骨形成,增加骨量,可能是治療骨質(zhì)疏松的潛在選擇。