余美玲 馬翔 董淑英 童旭輝

肝細胞癌（肝癌）是我國第四高發(fā)的惡性腫 瘤，其致死率在所有惡性腫瘤中排名第二［1］。細胞縫隙連接（GJ）是細胞之間的一種蛋白質(zhì)連接通道，由特殊的通道蛋白［連接蛋白（Cx）］組成［2］。研究顯示，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程往往伴隨著Cx表達的降低或者缺失，而上調(diào)或恢復腫瘤細胞中的Cx 表達水平，可抑制腫瘤細胞的生長、分化，降低細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力，逆轉(zhuǎn)耐藥［3-6］。Cx32在正常肝細胞表達的主要連接蛋白中占90%，是肝細胞縫隙連接最主要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［7］。在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，Cx32 表達水平會明顯下降［7］。Src/局部黏著斑激素（FAK）信號通路在多種腫瘤細胞中持續(xù)性激活，Src 是一種相對分子量為60 kDa 的非受體酪氨酸激酶。對于人源的Src 而言，主要的磷酸化位點包括激酶區(qū)負責活化的pTyr416位點和C 端尾鏈抑制性的pTyr530 位點。當激活時，Src 在酪氨酸殘基 416 位點自磷酸化，因此在本研究中主要分析了p-Src Y416 的表達水平。Src可以激活Src 蛋白的細胞質(zhì)復合物蛋白，如FAK。人FAK 含有6 個可以被磷酸化的酪氨酸，Tyr397、Tyr407、Tyr576、Tyr577、Tyr861、Tyr925。 筆 者在前期研究證實，肝癌細胞中Cx32 是Src/FAK 信號通路的上游調(diào)控因子［4］。為進一步探討Cx32、Src/FAK 信號通路在預測肝癌患者預后中的作用，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上對97 例接受肝癌根治性手術(shù)的患者進行隨訪，分析肝癌組織中Cx32、Src/FAK 的表達水平與患者預后之間的關(guān)系。

對象與方法

一、研究對象

收集2014 年1 至12 月在蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院肝膽外科接受根治性手術(shù)的97 例患者的肝癌組織標本和相應的癌旁組織標本（距離肝癌病灶2 cm 的肝組織）。所有標本均經(jīng)中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋， 5 μm 厚連續(xù)切片。所有患者術(shù)前都未接受放射治療、化學治療和免疫治療等相關(guān)治療。對患者進行隨訪，隨訪時間至2019 年12月，最終入組97 例。本研究方案經(jīng)蚌埠醫(yī)學院倫理委員會批準（批件號：［2020］第120 號），患者均已簽署知情同意書。

二、方 法

1. 臨床資料收集

收集97 例患者的臨床資料，包括年齡、性別、是否肝硬化、是否乙型肝炎、腫瘤最長直徑、有無包膜、甲胎蛋白水平、腫瘤分化程度、生存與否或死亡時間。分層分析時將肝癌分化程度依據(jù)《肝臟活檢病理解讀（第2 版）》分為高分化（肝癌組織接近正常組織，惡性程度低）、中分化（肝癌組織與正常組織差別不大，中度成熟，中度惡性程度）、低分化（肝癌組織與正常組織相差大，成熟度差，惡性度高）3 種情況；根據(jù)甲胎蛋白水平分為 ≤400 μg/L 和＞ 400 μg/L 2 種情況。

2. 免疫組織化學（免疫組化）染色法檢測

使用免疫組化染色法檢測Cx32、磷酸化-Src（p-Src）Y416、 總Src（total Src）、 磷 酸 化FAK（p-FAK）Y925、總FAK（total FAK）在肝癌組織以及相應癌旁組織中的蛋白表達：取病理組織切片脫蠟，梯度乙醇水化，枸櫞酸鹽緩沖液（pH =6.0）高溫修復，3% 過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶后滴加血清封閉；然后將切片與一抗在4 ℃孵育過夜，復溫后滴加二抗室溫下孵育 15 min，二氨基聯(lián)苯胺顯色5 min；蘇木精復染，脫水透明后中性樹膠封片。以細胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達，按陽性細胞所占百分比評分：＜5%為（-），5%～10% 為（+），11%～50% 為（++），51%～75%為（+++），＞75%為（++++）［8］。分層分析時將不表達和表達（+）歸為低表達，表達（++ ～++++）歸為高表達。

三、統(tǒng)計學處理

使用SPSS 20.0 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用配對χ2檢驗。采用單因素Cox 回歸分析收集到的肝癌手術(shù)患者的各項指標與肝癌術(shù)后患者的生存預后是否有關(guān)。將單因素Cox 回歸分析結(jié)果中有統(tǒng)計學意義的指標納入多因素Cox 回歸模型（納入法），分析肝癌術(shù)后患者生存的影響因素。通過繪制生存曲線（Kaplan-Meier 法）以及對數(shù)秩檢驗（Log-rank test）探討Cx32、p-Src Y416、p-FAK Y925 蛋白表達與患者生存時間的關(guān)系。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、研究對象的基本信息

97 例肝癌患者中，男72 例、女25 例，年齡25～78 歲、中位年齡55 歲；肝硬化77 例（79%），乙型肝炎66 例（68%）；甲胎蛋白＞ 400 μg/L 28例（29%）；低分化17 例（18%），中分化70 例（72%），高分化10 例（10%）；肝癌標本無包膜82 例（85%）；腫瘤最大直徑＞ 5 cm 54 例（56%）；隨 訪5 年 最 終 生 存55 例（57%）， 死 亡42 例（43%）。

二、Cx32、Src/FAK 蛋白在肝癌組織以及相應的癌旁組織中的表達情況

免疫組化染色結(jié)果顯示，肝癌組織的Cx32蛋白表達陽性率低于相應的癌旁組織，其p-Src Y416、 total Src、 p-FAK Y925、total FAK 的蛋白表達陽性率均高于相應的癌旁組織（P 均＜ 0.05），見表1 及圖1。97 例肝癌組織以及相應癌旁組織中各蛋白的具體表達情況見表2。

圖1 肝癌組織與癌旁組織的Cx32、p-Src Y416、p-FAK Y925、total Src、total FAK 蛋白表達比較（免疫組化染色，×200）

表1 97 例肝癌組織以及相應的癌旁組織中Cx32、Src/FAK 蛋白的表達情況［例（%）］

表2 97 例肝癌組織以及相應的癌旁組織中Cx32、Src/FAK 蛋白的具體表達情況［例（%）］

三、97 例肝癌根治性術(shù)后患者死亡的單因素和多因素Cox 回歸分析結(jié)果

單因素回歸分析顯示，肝癌患者死亡有8 項可疑影響因素，分別為年齡、腫瘤分化程度、腫瘤直 徑、Cx32、p-Src Y416、total Src、p-FAK Y925、total FAK 蛋白的表達（P 均＜ 0.05）。多因素回歸分析顯示，性別、甲胎蛋白＞ 400 μg/L、乙型肝炎、包膜、腫瘤長徑和total FAK 的蛋白表達均非肝癌患者死亡的影響因素（P 均＞ 0.05）。高表達Cx32 的肝癌患者死亡的風險可能為低表達Cx32 患者的12%（P ＜ 0.05）；高表達p-Src 的肝癌患者死亡的風險是低表達p-Src 肝癌患者的14.306 倍（P＜ 0.05）；高表達p-FAK 的肝癌患者死亡的風險是低表達p-Src 肝癌患者的12.152 倍（P ＜ 0.05）。另外，年齡和高表達Total Src 為獨立危險因素，中分化（與低分化對照）為獨立保護因素（P 均＜0.05），見表3。

表3 97 例肝癌患者單因素和多因素分析結(jié)果

四、Cx32、p-Src Y416、p-FAK Y925 與97例肝癌術(shù)后患者總體生存時間的關(guān)系

生存分析顯示，肝癌患者中Cx32 高表達者與Cx32 低表達者的生存率分別為46.39%、10.31%（log-rankχ2= 23.856，P ＜ 0.001）；p-Src Y416 低表達者與p-Src 高表達者的生存率分別為45.36%、11.34%（log-rankχ2= 56.637，P ＜ 0.001）；p-FAK Y925 低表達者與p-FAK Y925 高表達者的生存率分別為42.27%、14.43%（log-rankχ2= 43.599，P ＜0.001），見圖2。

圖2 Cx32、p-Src Y416、p-FAK Y925 的生存曲線（Kaplan-Meier 法）

討 論

Cx32 是肝癌細胞最主要的連接蛋白。研究證實，Cx32 表達下降會促進肝癌的進展、化學治療耐藥，提高腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移能力［3-4，7］。但Cx32能否作為肝癌的預后預測因子還有待于進一步驗證。Sheen 等（2004 年）的研究顯示，低表達Cx32 mRNA 的肝癌術(shù)后患者預后差，但該研究樣本量僅34 例。本研究共收集并成功隨訪97 例肝癌患者，驗證了與低表達Cx32 的患者相比，高表達Cx32 可能是肝癌患者術(shù)后死亡的獨立保護因素，Cx32 有望成為預測肝癌術(shù)后患者預后的標志蛋白。

Src/FAK 信號通路在多種腫瘤細胞中持續(xù)性激活［9-10］。Src 在細胞外可以激活Src 蛋白的細胞質(zhì)復合物蛋白，如FAK 等，Src-FAK 復合物與許多底物的復合物相互作用，包括Crk 相關(guān)基質(zhì)、樁蛋白和p190RhoGAP， 他們在細胞的生長、增殖過程中起重要作用。Src 也可以通過SH2 區(qū)域與FAK的C 末端酪氨酸殘基結(jié)合而磷酸化而使FAK 激活，激活的FAK 調(diào)節(jié)B1 整聯(lián)蛋白的活性，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、增殖。Src/FAK 信號通路的激活可促進腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、化學治療耐藥，筆者前期研究顯示，Src/FAK 信號通路的激活會促進肝癌細胞對多柔比星產(chǎn)生耐藥［4］。但Src/FAK 信號通路與肝癌患者生存預后的關(guān)系仍有待于進一步探討。Chen 等（2011 年）的研究顯示高表達的p-Src Y416 是肝癌患者死亡的獨立危險因素，低表達患者有更長的生存期。本研究顯示，高表達p-Src Y416、p-FAK Y925 是肝癌患者死亡的獨立危險因素，進一步明確了Src/FAK 信號通路與肝癌術(shù)后患者生存預后的關(guān)系。

結(jié)合筆者既往研究，本研究表明Src 是Cx32在腫瘤細胞中重要的下游調(diào)控因子。Sato 等（2007年）研究顯示，Cx32 可以通過抑制腎癌細胞Src的活性而抑制腫瘤的侵襲；Fujimoto 等（2005 年）通過Src-STAT3 信號通路抑制血管內(nèi)皮生長因子介導的血管生成；Hada 等（2006 年）研究顯示，Cx32 通過抑制A549 肺腺癌細胞Src 的活性而抑制腫瘤細胞的增殖及遷移；Sato 等（2013 年）研究表明Cx32 還可以通過抑制Src 的活性來增加長春堿在人腎細胞癌中的毒性作用。上述研究均說明，Cx32 可通過影響Src 的活性而調(diào)控腫瘤細胞的生長、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移以及化學治療的細胞毒性。但在肝癌細胞中Cx32 如何調(diào)控Src/FAK 信號通路尚未闡明。Finn 等（2008 年）報道，Src 能被胞質(zhì)中的蛋白激活，因此推測隨著肝癌的發(fā)生、發(fā)展、耐藥的發(fā)生，Cx32 會從細胞膜上異位至胞質(zhì)中，從而激活Src，下一步我們將進行研究驗證該推測。

由于本研究中Cox 多因素回歸分析中，高表達Cx32 對肝癌術(shù)后患者的影響P 值為0.049，故本研究進一步分析Cx32、Src/FAK 信號通路與接受肝癌根治性手術(shù)后患者生存預后的關(guān)系，結(jié)果顯示，低表達Cx32、高表達p-Src Y416、p-FAK Y925 患者生存預后差，患者中位生存期明顯縮短，Cx32、p-Src Y416、p-FAK Y925 可能為肝癌術(shù)后患者預后的標志。

本研究雖初步證實了肝癌組織中低表達Cx32、高表達p-Src Y416、p-FAK Y925 是肝癌患者預后的獨立危險因素，但樣本量仍偏小，后續(xù)研究中將繼續(xù)增加樣本量，收集多中心的臨床數(shù)據(jù)和標本，并設置更長的隨訪期，進一步探討Cx32、Src/FAK 信號通路與肝癌術(shù)后患者臨床預后的關(guān)系，明確Cx32、p-Src Y416、p-FAK Y925 是否能作為肝癌術(shù)后患者預后的標志蛋白。