周凱 吳俊宏 梁護(hù) 黃格朗

缺血性腦卒中患者側(cè)支循環(huán)的建立與腦卒中的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系，良好的側(cè)支循環(huán)既可補(bǔ)充或代償缺血區(qū)域細(xì)胞的缺血缺氧狀況，提高急性血管再通治療獲益率，又可改善微循環(huán)血供，保護(hù)微循環(huán)結(jié)構(gòu)和功能，改善患者預(yù)后［1-2］。研究表明，燈盞細(xì)辛能夠擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)，從而增加心腦血管的供血量，但是其作用機(jī)制尚未闡明。CT 灌注成像（CTP）能夠準(zhǔn)確地評估感興趣區(qū)（ROI）的血供及側(cè)支循環(huán)建立的情況，為腦梗死患者的診斷和療效評估提供影像學(xué)依據(jù)［3］。本研究擬通過CTP 了解缺血性腦卒中患者側(cè)支循環(huán)的建立，結(jié)合患者血清血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）、血管生成素-1（Ang-1）以及康復(fù)功能的動態(tài)變化，進(jìn)一步探討燈盞細(xì)辛的作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

對象與方法

一、研究對象

選擇2018 年1 至12 月在本院神經(jīng)內(nèi)科和康復(fù)科住院的60 例缺血性腦卒中患者。本研究為隨機(jī)雙盲前瞻性試驗，按電腦生成隨機(jī)數(shù)字分組，其中治療組納入32 例、對照組納入28 例。研究過程中治療組脫落3 例，對照組脫落2 例，最后納入治療組29 例、對照組26 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：首次發(fā)作并經(jīng)頭顱CT 或MRI 證實缺血性腦卒中，且起病 48 h 以內(nèi)未進(jìn)行靜脈或動脈溶栓者；病灶主要在大腦中動脈供血區(qū)域范圍，單側(cè)首次發(fā)病，或有腦梗死病史但癥狀緩解未見后遺癥者；有神經(jīng)系統(tǒng)受損的定位體征，美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評分為4～20 分，生命體征穩(wěn)定者；不影響交流并能夠完成指令性動作者［4］。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往有顱內(nèi)出血、占位或發(fā)生過腦外傷及其他腦部疾病者；本次發(fā)病頭顱CT 或MRI 示腦梗死并且合并腦出血或者出血性轉(zhuǎn)化者；短暫性腦缺血發(fā)作并且伴有嚴(yán)重意識障礙的重度腦梗死者；合并其他系統(tǒng)病變例如器官功能受損、全身出血傾向或惡性腫瘤等者。本研究經(jīng)貴港市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：Z20180121），入組患者或其授權(quán)家屬均已簽署知情同意書。

二、方 法

1. 治療方法

患者入院后均依據(jù)《中國急性缺血性腦卒中診治指南 2014》予常規(guī)治療［4］。在此基礎(chǔ)上，治療組患者靜脈滴注燈盞細(xì)辛注射液30 mL（用250 mL生理鹽水稀釋后使用），每日1 次，連續(xù)治療2 周；予對照組患者250 mL 生理鹽水靜脈滴注，每日1次，連續(xù)治療2 周。2 組患者均于生命體征穩(wěn)定后立即進(jìn)行床邊康復(fù)治療。本研究為藥物干預(yù)的臨床試驗，隨機(jī)分組對治療師、受試者及結(jié)果測量者實施盲法，治療過程中對治療師、受試者實施盲法，由研究人員統(tǒng)一配發(fā)藥物。

2. CTP 檢查方法

分別于患者入院當(dāng)日（治療前）和入院第30日，采用西門子SOMATOM 64 層雙源螺旋CT 掃描儀。CTP 參數(shù)設(shè)為80 kV、160 mAs，以5.0 mL/s速度團(tuán)注50 mL 碘海醇和30 mL 生理鹽水后，延遲2 s 啟動掃描，平掃層厚5 mm，間距5 mm。CTP圖像處理：對比首次CT 平掃，在顱腦CTP 圖像上確定梗死中心及周圍半暗帶區(qū)，選擇CTP 圖像中梗死范圍最大的層面進(jìn)行測量，手工勾畫ROI，測量相應(yīng)區(qū)域的腦血流量（CBF）、腦血容量（CBV）、達(dá)峰時間（TTP）以及平均通過時間（MMT）。

3. 檢測指標(biāo)

分別于入院第1 日（治療前）、治療第14 日和入院第30 日清晨患者空腹?fàn)顟B(tài)下抽取其肘靜脈血2.5 mL，室溫放置1 h 后，3000 轉(zhuǎn)/分離心10 min，分離血清，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。ELISA 法檢測血清VEGF、HIF-1α 和Ang-1 蛋白含量。

4. 康復(fù)評估指標(biāo)

分別于治療前、治療第14 日和入院第30 日使用NIHSS 評分評價患者的神經(jīng)功能缺損程度、Barthel 指數(shù)（BI）評分評定患者的日常生活能力，比較2 組患者的評分，分析治療效果。神經(jīng)功能缺損程度依據(jù)TOAST 分型研究并結(jié)合本課題納入標(biāo)準(zhǔn)，按患者的NIHSS 評分分為輕度（4～6 分）、中度（7～15 分）和重度（16～20 分）［5］。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 18.0 處理數(shù)據(jù)。計量資料經(jīng)檢驗為正態(tài)分布，以 表示，組間比較采用成組設(shè)計的t 檢驗，組內(nèi)入院第1 日與第30 日的比較采用配對t 檢驗；多時點的重復(fù)測量數(shù)據(jù)用重復(fù)測量資料方差分析，因交互效應(yīng)P 均＜ 0.001，故比較采用簡單t 檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗?？傮w比較以P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，組內(nèi)多時點間兩兩比較采用Bonferroni法校正，即P ＜ 0.017 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、治療組與對照組缺血性腦卒中患者的一般資料比較

治療組與對照組缺血性腦卒中患者的年齡、性別構(gòu)成及治療前NIHSS 評分比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞ 0.05）。見表1。

表1 治療組與對照組缺血性腦卒中患者的一般資料比較

二、治療組與對照組缺血性腦卒中患者的CTP 指標(biāo)比較

治療前，2 組缺血性腦卒中患者的CTP 指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞ 0.05）。除對照組入院第30 日的CBV 與治療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）外，2 組其他CTP 指標(biāo)在入院第30 日與治療前比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05）。入院第30 日，治療組的CBF 和CBV 高于對照組（P 均＜ 0.05），TTP 及MMT 均短于對照組（P 均＜ 0.05），見表2。治療組1 例典型病例在應(yīng)用燈盞細(xì)辛治療前后的CTP 檢查結(jié)果見圖1。

圖1 一例缺血性腦卒中患者在應(yīng)用燈盞細(xì)辛治療前后的CTP 檢查結(jié)果

表2 治療組與對照組缺血性腦卒中患者的CTP 指標(biāo)比較（±s）

表2 治療組與對照組缺血性腦卒中患者的CTP 指標(biāo)比較（±s）

注：與治療前比較 ，aP ＜ 0.05。

CBF/［mL/（100 g·min）］ CBV/（mL/100 g） TTP/s MMT/s治療前 入院第30 日 治療前 入院第30 日 治療前 入院第30 日 治療前 入院第30 日治療組 29 25.9±12.1 36.0±10.9a 2.00±1.01 2.48±1.04a 19.1±6.5 14.3±4.9a 4.51±1.30 3.30±0.89a對照組 26 27.1±10.4 29.3±9.6a 1.85±0.64 1.93±0.62 19.8±5.5 17.2±4.8a 4.36±1.09 3.88±0.97a t 值 0.383 2.469 0.649 2.347 0.452 2.226 0.461 2.313 P 值 0.703 0.020 0.519 0.023 0.653 0.030 0.647 0.025組 別 例數(shù)

三、治療前后治療組與對照組缺血性腦卒中患者的血清學(xué)指標(biāo)水平比較

治療第14 日，對照組血清VEGF 水平與入院第1 日比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.017），HIF-1α 水平較治療前下降，Ang-1 水平則明顯升高（P均＜ 0.017）；治療組的各血清學(xué)指標(biāo)與治療前比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜ 0.017），其中血清VEGF 和Ang-1 水平增加，血清HIF-1α 水平下降；治療組血清VEGF、HIF-1α 和Ang-1 水平均高于對照組（P 均＜ 0.05）。入院第30 日，對照組血清VEGF 水平與治療第14 日相近（P ＞ 0.017），血清HIF-1α 與Ang-1 水平較治療第14 日下降（P 均＜0.017）；治療組血清VEGF、HIF-1α 水平較治療第14 日明顯下降（P 均＜ 0.017），但是與對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＞ 0.05），血清Ang-1 水平較治療第14 日減低（P ＜ 0.017）而高于對照組（P ＜ 0.05），見表3。

表3 治療前后2 組缺血性腦卒中患者的血清VEGF、HIF-1α、Ang-1 水平比較（±s） 單位：ng/L

表3 治療前后2 組缺血性腦卒中患者的血清VEGF、HIF-1α、Ang-1 水平比較（±s） 單位：ng/L

注：與治療前比較，aP ＜ 0.017；與治療第14 日比較，bP ＜ 0.017。

組 別 例數(shù)VEGF HIF-1α Ang-1治療前 治療第14 日入院第30 日治療組 29 735±166 996±166a 821±176b 975±231 723±178a 358±113ab 21.9±5.4 38.0±8.9a 26.6±5.9ab對照組 26 712±166 801±184 751±170 916±252 616±195a 354±121ab 23.0±5.4 29.7±6.1a 22.4±4.9b t 值 0.529 4.131 1.496 0.907 2.132 0.155 0.738 4.016 2.820 P 值 0.599 ＜0.001 0.141 0.309 0.038 0.877 0.464 ＜0.001 0.007第30 日 治療前 治療第14 日入院第30 日 治療前 治療第14 日入院

四、治療期間治療組與對照組缺血性腦卒中患者的康復(fù)評分比較

2 組缺血性腦卒中患者的NIHSS 評分均隨治療時間的延長而降低（P 均＜ 0.05）， BI 評分則均隨治療時間的延長而升高（P 均＜ 0.05）。治療第14日及入院第30 日，治療組NIHSS 評分均較對照組降低，BI 評分則較對照組升高（P 均＜ 0.05），見表4。

表4 治療組與對照組缺血性腦卒中患者的NIHSS、BI 評分比較（±s） 單位：分

表4 治療組與對照組缺血性腦卒中患者的NIHSS、BI 評分比較（±s） 單位：分

注：與治療前比較，aP ＜ 0.017；與治療第14 日比較，bP ＜ 0.017。

組 別 例數(shù) NIHSS 評分 BI 評分治療前 治療第14 日 入院第30 日 治療前 治療第14 日 入院第30 日治療組 29 15.3±3.1 8.7±1.9a 5.8±1.6ab 26.9±9.8 52.8±10.7a 70.7±10.9ab對照組 26 15.3±3.2 11.2±2.5a 8.1±1.6ab 30.4±8.8 43.7±10.2a 65.2±7.1ab t 值 0.047 4.308 5.549 1.380 3.179 2.183 P 值 0.963 ＜0.001 ＜0.001 0.173 0.002 0.034

討 論

急性腦卒中治療的主要目的為挽救缺血半暗帶，其重點在于開通閉塞血管、開放側(cè)支循環(huán)。CTP 中參數(shù)CBF/CBV“不匹配”是目前急診狀態(tài)下快速評價缺血半暗帶最簡單、實用的方法［6］。已有動物實驗及臨床對照研究表明，中藥通過影響血管新生調(diào)節(jié)因子促進(jìn)血管新生、改善急性缺血性卒中患者側(cè)支循環(huán)，從而發(fā)揮中藥防治腦卒中的積極作用［7-8］。本研究顯示，治療組患者在入院第30 日， 其CBF、CBV 均較治療前增加，TTP、MMT則較治療前縮短，這可能與原缺血半暗帶側(cè)支循環(huán)的建立、腦組織血流量及血容量增加有關(guān)，而治療組上述CTP 指標(biāo)的改善程度均較對照組明顯，提示燈盞細(xì)辛注射液在促進(jìn)缺血半暗帶側(cè)支循環(huán)的形成上效果明顯。

燈盞細(xì)辛可能通過補(bǔ)體和凝血級聯(lián)通路、HIF-1 信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B 信號通路、叉頭框蛋白O 亞型信號通路、核因子-κB 信號通路和脂肪細(xì)胞因子信號通路等多靶點、多通路治療缺血性腦卒中，其與VEGF 信號通路關(guān)系密切［9-10］。VEGF 是血管再生的關(guān)鍵因子，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，加快新生細(xì)胞的增殖及血管新生，對側(cè)支循環(huán)的重塑和建立具有重要意義。據(jù)動物研究顯示，燈盞細(xì)辛可明顯增加局灶性腦缺血大鼠血清VEGF 及其受體的表達(dá)，并增加局部腦血流量［11］。在缺血性腦卒中大鼠模型中注射有生物學(xué)標(biāo)記的水凝膠，使VEGF 緩慢釋放，可觀察到病灶周圍皮層血管化明顯增加，保留病灶周圍區(qū)域的血管再生和神經(jīng)元，最終大鼠的神經(jīng)功能得以恢復(fù)［12］。

HIF-1α 是氧穩(wěn)態(tài)的敏感調(diào)節(jié)劑，在缺血缺氧后其表達(dá)迅速增加［13］。HIF-1α 的穩(wěn)定和促血管生成特性可對缺血后神經(jīng)損傷有保護(hù)作用［14］。大鼠腦缺血時大腦中HIF-1α 的缺失可導(dǎo)致VEGF-A 表達(dá)水平不足［15］。缺氧環(huán)境下， HIF-1α 與VEGF 的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合，促進(jìn)VEGF 轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。研究顯示，HIF-1α 的表達(dá)與VEGF 以及微血管密度呈正相關(guān)，在大腦中動脈閉塞大鼠模型中，調(diào)節(jié)HIF-1α 和VEGF 信號通路可實現(xiàn)對神經(jīng)血管單位的保護(hù)［16］。增加HIF-1α 的含量和表達(dá)，促進(jìn)血管和神經(jīng)再生，從而減少神經(jīng)元死亡和改善神經(jīng)功能［17］。HIF-1α 抑制劑YC-1 可抑制缺血性卒中小鼠模型中HIF-1α 的表達(dá)，且伴隨VEGF-A 和CD34 表達(dá)減少，血管生成和神經(jīng)恢復(fù)明顯減慢［18］。但也有研究表明，HIF-1α 可使血腦屏障損害和緊密連接的破壞加劇，導(dǎo)致腦梗死面積增大和神經(jīng)功能缺損［19］。在急性腦缺血期間，抑制HIF-1α 與基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和VEGF 的相互作用可減少血腦屏障的損傷［20］。本研究中，HIF-1α 水平在缺血性腦卒中患者發(fā)病早期明顯升高并達(dá)到高峰后，隨時間延長而逐漸下降；與對照組比較，經(jīng)燈盞細(xì)辛藥物干預(yù)14 d 后治療組的HIF-1α 下降幅度較小，可能與其啟動VEGF 表達(dá)相關(guān)，以避免下降過快所引起的血腦屏障破壞。

Ang 是一類特異性作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長因子，其中以Ang-1 和Ang-2 的作用最為明顯，其通過上調(diào)VEGF、Ang-1 的表達(dá)激活Sonic 刺猬信號通路，增加大鼠腦微血管生成來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［21］。慢性腦缺血大鼠于成模2 周的Ang-1 表達(dá)水平下降，經(jīng)藥物處理后其表達(dá)水平則上升，且調(diào)節(jié)Ang-1/Ang-2/Tie-2 信號軸可促進(jìn)早期新生血管形成［22］。本研究顯示，治療組在治療第14 日時Ang-1 水平與治療前、對照組比較均有所升高；2組在入院第30 日時Ang-1 表達(dá)水平逐漸下降，但治療組Ang-1 下降水平相對緩慢，考慮燈盞細(xì)辛后對Ang-1 作用持續(xù)時間較長，相對的高表達(dá)可持續(xù)發(fā)揮其促血管新生作用。

燈盞細(xì)辛的腦保護(hù)作用機(jī)制可能與促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子等作用有關(guān)。本研究中，急性缺血性腦卒中發(fā)生后，患者血清VEGF、Ang-1 的表達(dá)增高，在停藥半個月后與對照組比較仍能維持血清VEGF、Ang-1 的較高表達(dá)，提示燈盞細(xì)辛對VEGF、Ang-1 有明顯的后續(xù)作用，其機(jī)制可能是燈盞細(xì)辛啟動HIF-1α 后，使VEGF 表達(dá)升高，并與Ang-1 相互作用，提高VEGF 與內(nèi)皮細(xì)胞間的敏感性，最終誘導(dǎo)VEGF 促進(jìn)細(xì)胞增生、形成側(cè)支循環(huán)。

血管新生是近年研究的熱點，血管新生程度與腦梗死面積大小關(guān)系密切，促血管新生中藥的靶向治療具有廣闊的前景。本研究的不足之處是僅選擇大腦中動脈供血區(qū)域作為研究對象的病灶，范圍相對局限，且對腦卒中患者康復(fù)治療的觀察時間相對較短，未能完全反映患者的預(yù)后。筆者相信隨著日后研究的不斷深入，燈盞細(xì)辛的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制會更明確，將為臨床腦血管疾病的治療提供更可靠的理論依據(jù)。