何萍 沈佳 徐丹 王紫燕

蘇州大學附屬兒童醫(yī)院檢驗科（江蘇蘇州 215003）

抗中性粒細胞胞漿抗體（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）是一組針對中性粒細胞胞漿顆粒中主要表達蛋白的自身抗體，通過間接免疫熒光可以區(qū)分ANCA 的不同模式，即細胞質(zhì)模式、核周模式和不典型模式[1]。不同模式常對應不同的靶抗原，如髓過氧化物酶（MPO）與核周型ANCA（p-ANCA）相關，蛋白酶3（PR 3）與胞漿型ANCA（c-ANCA）相關。自身抗體，如抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體和抗可提取核抗原（ENA）抗體，以及補體活性的變化可反映系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）疾病活動或治療效果[2]。ANCA主要與ANCA相關血管炎（ANCA-associated vasculitis，AAV）有關，對于具有臨床特征的AAV患者，ANCA 陽性提供了較高的診斷價值（約95%的敏感性和90%的特異性）。許多SLE 患者ANCA可以陽性，尤其是p-ANCA。然而ANCA 對于兒童SLE 臨床癥狀、疾病活動性和預后轉歸的預測作用尚不清楚。與成人發(fā)病的SLE 相比，兒童SLE 更具侵襲性，疾病活動性更高，診斷時癥狀更嚴重，腎臟、心血管和神經(jīng)精神受累的發(fā)生率更高[3]。本研究主要分析p-ANCA 陽性對于兒童SLE 的其他自身抗體、免疫功能、腎功能以及腎臟病理結果的影響。

1 對象與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2016年1月至2021年7月在蘇州大學附屬兒童醫(yī)院就診的SLE患兒的臨床資料。研究對象納入標準：①年齡1 個月至18 歲；②依據(jù)中華醫(yī)學會風濕病學分會制訂的《系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷及治療指南》中的診斷標準[4]確診為SLE；③完成血清ANCA 及相關實驗室檢查；④排除感染、腫瘤和其他結締組織病。

SLE 患兒根據(jù)p-ANCA 檢測結果分為p-ANCA陽性組和p-ANCA陰性組。

本研究通過蘇州大學附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準（批準文號：2015LW005），并獲得家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集 收集患兒年齡、性別，自身抗體包括抗雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）抗體、抗史密斯（Smith，Sm）抗體、抗干燥綜合征抗原A（Sj?gren's syndrome antigen A，SSA）抗體、抗硬皮病-70（scleroderma-70，Scl-70）抗體、抗著絲點蛋白B（centromere protein B，CENP-B）抗體、抗干燥綜合征抗原B（Sj?gren's syndrome antigen B，SSB）抗體、抗組氨酰tRNA 合成酶（Jo-1）抗體、抗U1-n核糖核蛋白抗體/史密斯抗體（抗U 1-nRNP/Sm 抗體）、抗組蛋白抗體、抗核糖核蛋白（anti-ribosome ribonucleoprotein，rRNP）抗體、抗核小體抗體、抗Ro-52 抗體、抗多發(fā)性肌炎/硬皮?。╬olymyositis-scleroderma，PM-Scl）抗體、抗增殖細胞核抗原抗體（proliferating-cell nuclear antigen antibody，PCNA）、抗線粒體抗體-M 2 型（antimitochondrial antibody-M2，AMA-M2）抗體，及免疫功能和腎功能相關指標、腎臟病理檢查結果。

1.2.2 檢測指標及方法 研究對象入院時抽取9～12 mL靜脈血，以離心力3 000×g離心15 min后，分離血清?？购丝贵w（antinuclear antibodies，ANA）、抗dsDNA 抗體及ANCA采用間接免疫熒光法（IIF）在歐蒙全自動熒光酶聯(lián)免疫分析一體機Sprinter XL檢測，EUROPattern 全自動熒光顯微鏡判讀結果。通過三基質(zhì)ANCA判讀順序排除ANA的干擾。第一張基質(zhì)粒細胞（乙醇固定）判斷ANCA 陰性或陽性以及cANCA或pANCA。第二張基質(zhì)粒細胞（甲醛固定）判斷pANCA甲醛敏感或抗性。第三張為Hep-2與粒細胞混合包被基質(zhì)，①當僅存在ANCA時，可見粒細胞熒光著色，而Hep-2未見熒光或僅有微弱熒光，在同一視野下粒細胞熒光強度明顯強于相鄰的Hep-2細胞；②當同時存在ANA和ANCA時可見Hep-2與粒細胞混合包被基質(zhì)上Hep-2和粒細胞均有熒光著色，且同一視野下粒細胞的熒光強度明顯強于相鄰的Hep-2 細胞；③當只存在ANA 時，Hep-2 與粒細胞混合包被基質(zhì)上可以觀察到所有細胞核均有熒光著色，Hep-2和粒細胞上的熒光強度相似。ANCA相關特異性靶抗原包括過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、蛋白酶 3（proteinase 3，PR3）和抗腎小球基底膜（glomemlar basement membrane，GBM）抗體檢測采用免疫印跡法在歐蒙EUROLineMaster Plus自動免疫印跡AN 儀上測定。所有標本均嚴格按照操作規(guī)程進行檢測。體液免疫相關項目包括補體（C3、C4）、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM），采用免疫比濁法用西門子ADVIA 2400 全自動生化分析儀檢測。尿肌酐（UCr）、尿IgG（UIgG）、α 1 微球蛋白（α 1-MG）、β 1 微球蛋白（β 1-MG）、尿轉鐵蛋白（U-TRF）、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）和尿微量白蛋白（UMA）采用免疫投射比濁法在日立全自動生化分析儀7180 上檢測。尿蛋白、尿隱血在尿液分析儀AUTION MAX UrilyzerAuto上檢測。尿隱血紅細胞≥50個/μL和尿蛋白＞50 mg/dL為陽性。ANA滴度≥1:320為陽性，dsDNA≥1:32為陽性。免疫印跡法測定抗核抗體譜及ANCA 特異性抗體結果，灰度值15～20為陽性。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的以中位數(shù)（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

共納入191 例SLE 患兒，女160 例、男31 例，平均年齡（12.0±3.5）歲。pANCA 陽性組81 例（42.4%），男13例、女68例，平均年齡（12.7±3.2）歲；pANCA 陰性組110 例，男14 例、女96 例，平均年齡（11.4±3.6）歲。兩組間性別（χ2=0.42，P=0.515）、年齡（t=1.84，P=0.070）差異無統(tǒng)計學意義。

81例pANCA陽性患兒中，pANCA（甲醛抗性）陽性26例（32.1%），pANCA（甲醛敏感）陽性55例（67.9%）；抗髓過氧化物酶（MPO）抗體陽性29例，占pANCA 陽性患兒35.8%。抗腎小球基底膜抗體和抗MPO抗體同時陽性1例。

2.2 pANCA陽性和陰性組一般實驗室及自身抗體指標比較

與pANCA 陰性組相比，pANCA 陽性組血沉較高，Hb 較低，自身抗體中ANA、抗dsDNA 抗體、抗SSA抗體、抗CENP-B抗體、抗組蛋白抗體、抗rRNP抗體、抗核小體抗體以及抗Ro-52 抗體陽性率均較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 pANCA陽性和陰性組一般實驗室及自身抗體指標比較

2.3 pANCA陽性和陰性組免疫功能及腎功能比較

與pANCA 陰性組相比，pANCA 陽性組C 3 和C4較低，UCr、UIgG/UCr、α1-MG/UCr、β1-MG/UCr、NAG/UCr、UMA/UCr 較高，尿隱血和尿蛋白陽性比例較高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 pANCA陽性和陰性患兒免疫功能和腎功能相關指標比較

2.4 pANCA陽性和陰性組腎臟病理結果比較

共112 例SLE 患兒進行腎穿刺活檢，其中pANCA陰性患兒63例，pANCA陽性49例。光鏡下腎臟病理改變提示，pANCA陽性患兒有3例新月體形成。與pANCA 陰性組相比，pANCA 陽性組系膜增生比例較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。免疫熒光標記檢查提示，與pANCA陰性組相比，pANCA陽性組腎小球系膜和毛細血管袢IgG、IgM、IgA、C 1 q 和C 3 沉積比例較高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 pANCA陽性和陰性組腎臟病理結果比較[n (%)]

3 討論

兒童SLE是一種較少見但能引起全身各器官系統(tǒng)嚴重損害的自身免疫性疾病。和普通人群相比，兒童SLE的總體標準化死亡率（SMR）更高，特別是＜18 歲的住院患者，SMR（6.5）大約為正常人（所有年齡段SMR為2.2）的3倍[5]。發(fā)病年齡越?。ǎ?歲）患兒癥狀越不典型，并發(fā)癥和不良預后發(fā)生率越高[6]。由于個體間顯著的異質(zhì)性，兒童SLE 的診斷復雜，治療更為困難。

本研究SLE患兒中pANCA陽性率為 42.4%，相關靶抗原以MPO為主，陽性率占pANCA的35.8%，與成人報道一致[7]。原因可能為：①與pANCA 甲醛抗性的主要相關靶抗原為MPO，而pANCA 甲醛敏感的相關靶抗原有乳鐵蛋白、彈性蛋白酶、組織蛋白酶和溶菌酶及其他未知抗原[8]，需要更多的研究來發(fā)現(xiàn)這些未知的抗原；②pANCA 檢測及其相關靶抗原檢測的方法學不同使其檢測的陽性率有差異；③MPO 與p-ANCA 相關主要發(fā)生在AAV 患者中，而在ANCA的其他相關疾病這樣的相關性不明顯。

pANCA 在SLE 及其并發(fā)癥中的作用及其機制仍不明確。狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）患者體內(nèi)可能通過促進中性粒細胞脫顆粒和激活中性粒細胞，增加細胞表面 MPO 的表達，從而促進ANCA形成[9]。中性粒細胞可能在不同形式的細胞死亡過程中釋放中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs），NETs參與多種促進自身反應和組織損傷的自身免疫疾病的發(fā)病機制，包括SLE 和ANCA相關血管炎。NETs上的自身抗體導致更多的C1q沉積，導致無效的凈降解和促炎癥反應的惡性循環(huán)。同時，抗dsDNA抗體和抗ENA抗體陽性患者的凈降解效率受損，這與活動性SLE 患者疾病活動和腎臟受累有關[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，和pANCA 陰性組相比，pANCA陽性SLE 患兒Hb 降低并伴有血沉增快，表明pANCA可以反映SLE 活動情況。而Hb 降低可能與ANCA相關的血尿有關[11]。ANA 滴度和抗dsDNA 抗體陽性率在pANCA陽性組明顯高于pANCA陰性組，與既往的成人研究一致[7，12]。ENA的相關指標在大多數(shù)情況下隨著ANA 各種不同核型和滴度的變化而改變。因此ENA相關指標在一般情況下也能反映疾病進展和活動趨勢?？筪sDNA抗體被廣泛認為是用于診斷SLE 和評估疾病活動性的一項重要指標，同時也可以促使LN的發(fā)生?？筪sDNA抗體和ANA的致病性主要由免疫復合物形成引起，免疫復合物通過組織沉積或誘導細胞因子釋放引起全身性免疫細胞紊亂。目前篩查策略建議ANA 和抗dsDNA 抗體同時檢測，以識別所謂的“活動性、自身抗體陽性SLE”患者。由于疾病的自然史或治療的影響，ANA反應會隨著時間的推移而減少。對于已經(jīng)確診SLE的患者，定期ANA血清學檢測可闡明與發(fā)病機制和疾病狀態(tài)相關的變化[13]。

本研究SLE 患兒pANCA 陽性組補體C 3 和C 4水平低于pANCA陰性組，與國外研究結果一致[14]。但也有文獻報道，SLE患者C3和C4在pANCA陽性組和陰性組間無明顯統(tǒng)計學差異[9]。這可能因為研究對象的年齡不同，同時也提示pANCA在兒童SLE中的作用不同于成人。國內(nèi)文獻也提及補體下降在臨床上可作為SLE 和疾病進展的重要診斷線索，同時也是免疫功能紊亂的指標[15]；補體C 3 持續(xù)降低也是SLE腎臟損害的預測指標[16]。可能是由于脫氧核糖核酸酶-1 (deoxyribonuclease-1，DNase-1）抑制劑和NETs 抗體的存在阻止了DNase-1 進入NETs，DNase-1功能失效及NETs降解受損與腎臟受累、疾病活動性以及血液中C3和C4水平低有關。

pANCA對腎功能的影響尚無定論。有研究發(fā)現(xiàn)p-ANCA與LN相關[10]。也有研究報道在LN患兒中，ANCA陽性與血肌酐、腎小球濾過率、血尿、尿蛋白等腎損傷指標無關，但與腎臟病理改變有關[17]。本研究pANCA 陽性SLE 患兒比陰性患兒更容易發(fā)生系膜增生，而且p-ANCA 陽性組腎功能相關指標均高于陰性組，提示pANCA會加重腎功能和腎臟病理的損傷。不同研究結論的差異可能與SLE患者的年齡差異、疾病進展時期不同有關。

本研究兒童SLE 樣本較少，由于臨床病例資料不全，只收集腎臟病理的光鏡結果，并未對腎臟的病理資料進行分型，因此無法對pANCA與不同類型腎臟病理進行相關性分析。兒童SLE的臨床表現(xiàn)各不相同，pANCA可能與兒童SLE的疾病活動性和腎臟損害密切相關。