黃鐵蕾，李祥，王耀鳳，褚春年，史大虎

(1.廣西化工研究院有限公司，廣西 南寧 530000；2.陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710021； 3.西安市農(nóng)機(jī)監(jiān)理與推廣總站，陜西 西安 710000；4.陜西天蓬肥業(yè)有限公司，陜西 寶雞 722305)

豬血的蛋白質(zhì)、賴氨酸含量分別為17%～20%、14.1%[1-4]，含有多種活性物質(zhì)[5]，對植物根系發(fā)育、內(nèi)源激素合成、促進(jìn)葉片光合作用具有重要的作用。但存在蛋白質(zhì)容易變性、血腥味重的缺點(diǎn)[6]，給豬血貯藏及活性成分的提取(如SOD、CAT)帶來了困難。探索切實(shí)可行的豬血利用技術(shù)，對清潔屠宰環(huán)境、資源化利用豬血資源具有一定的意義。

本文以新鮮豬血為主要原料，以氨基酸態(tài)氮含量、臭氣指數(shù)為評價指標(biāo)，采用微生物發(fā)酵及硫酸水解復(fù)合技術(shù)，得到含氨基酸葉面肥，克服了酶法豬血肥料臭味大、施用困難及酸法豬血肥料酸用量大、二次污染的技術(shù)難題。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

新鮮豬血，來源于陜西天蓬肥業(yè)有限公司；米曲霉(50億/g)、黑曲霉(50億/g)、哈氏木霉(50億/g)均為山東合眾康源生物科技有限公司提供；易肥寶，湖南山河美環(huán)保科技有限公司；FT發(fā)酵菌劑(有效活菌數(shù)≥2×1010CFU/g)，武漢豐甜生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌，山東益昊生物科技有限公司。

HH-2恒溫水浴鍋；FA-N電子天平；78-1磁力攪拌器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微生物菌劑的選擇 取6個250 mL的三口燒瓶，分別加入100 mL豬血及10 g米曲霉、哈氏木霉、易肥寶、黑曲霉、FT發(fā)酵菌劑及枯草芽孢桿菌，在60 ℃攪拌反應(yīng)12 h。取適量樣品，離心分離，測定氨基酸態(tài)氮含量及臭味指數(shù)。

1.2.2 預(yù)處理方法對發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮含量、臭味指數(shù)的影響 取250 mL的三口燒瓶2個，第一個燒瓶中加入濃度為5%、碳氮比為1∶30的葡萄糖、尿素的混合液10 mL及10 g米曲霉，在32 ℃攪拌反應(yīng)0.5 h。加入20 mL新鮮豬血繼續(xù)反應(yīng)1 h，再加入 80 mL 豬血反應(yīng)2 h，升溫至60 ℃攪拌反應(yīng) 12 h。第二個燒瓶中直接加入10 g米曲霉及 100 mL 的新鮮豬血，在60 ℃攪拌反應(yīng)12 h。取適量樣品，離心分離，測定氨基酸態(tài)氮含量及臭味指數(shù)。

1.2.3 最佳發(fā)酵條件的確定 以米曲霉、黑曲霉不同配比、加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間為因素，按照表1進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以氨基酸態(tài)氮含量、臭味指數(shù)為評價指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵條件。

表1 豬血發(fā)酵的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design of pig blood fermentation

1.2.4 最佳酸解條件的確定 以硫酸濃度、豬血與硫酸的配比、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度為因素，按表2進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以氨基酸態(tài)氮含量、臭味指數(shù)為評價指標(biāo)，確定最佳酸解條件。

表2 豬血酸解的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Orthogonal experimental design of pig blood acidolysis

1.2.5 放大實(shí)驗(yàn) 1 500 mL的三口燒瓶中，加入濃度為5%、碳氮比為1∶30的葡萄糖/尿素的混合液100 mL及10 g米曲霉，在32 ℃攪拌反應(yīng)0.5 h。加入200 mL新鮮豬血，反應(yīng)1 h，加入800 mL豬血，繼續(xù)反應(yīng)2 h后，在60 ℃下攪拌反應(yīng)12 h。加入 4 mol/L 的硫酸100 mL，在100 ℃下反應(yīng)12 h。以氨基酸態(tài)氮含量、氨基酸含量、臭氣指數(shù)、水不溶物含量、pH值為評價指標(biāo)，確定廢棄豬血肥料化技術(shù)參數(shù)。

1.3 分析方法

1.3.1 氨基酸態(tài)氮含量測定 參見《GB 8186—2000釀造醬油》中氨基酸態(tài)氮的測定方法[7]。

1.3.2 氨基酸含量測定 參見《GB 17419—1988含氨基酸葉面肥料》中氨基酸含量測定方法[8]。

1.3.3 臭味指數(shù)測定 以6個人為一組，按照無臭味為0，輕微臭味為1，有臭味為2，明顯臭味為3，較強(qiáng)臭味為4，強(qiáng)烈臭味為5的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分[9]，計(jì)算平均值。注意打分時以10 s的間隔連續(xù)測定 5 min 的結(jié)果為宜。

2 結(jié)果與討論

2.1 微生物菌劑的選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 微生物菌劑種類對豬血發(fā)酵的影響Table 3 Effects of microbial agents on pig blood fermentation

由表3可知，微生物菌劑種類不同，發(fā)酵物中氨基酸態(tài)氮的含量、臭味指數(shù)不同，氨基酸態(tài)氮與臭味指數(shù)之間無相關(guān)性。以米曲霉為發(fā)酵菌劑，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮的含量最高，為0.364 2 g/100 mL，臭味指數(shù)為3.4。以哈氏木霉為發(fā)酵菌劑，發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮的含量為0.324 4 g/100 mL，臭味指數(shù)最低，為3.2。故米曲霉或米曲霉與哈氏木霉的復(fù)配物應(yīng)為廢棄豬血發(fā)酵的最佳菌劑。

米曲霉是一種好氧型真菌，其最佳培養(yǎng)溫度為30～35 ℃，在生長過程中產(chǎn)生3 999.2 U/g的蛋白酶[9]，蛋白酶的最適作用溫度為45～60 ℃[10]。

2.2 預(yù)處理方法對發(fā)酵液中氨基酸態(tài)氮含量、臭味指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表4可知，米曲霉經(jīng)活化處理后對豬血的降解效率明顯增加，臭味指數(shù)下降，其原因是活化處理促進(jìn)了米曲霉孢子萌發(fā)、菌體生長、繁殖，縮短了米曲霉對數(shù)生長期到來的時間，在此過程中產(chǎn)生大量的蛋白酶，促進(jìn)了豬血的降解。

表4 預(yù)處理方法對發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮、 臭味指數(shù)的影響Table 4 Effects of pretreatment methods on amino acid nitrogen and odor index of fermentation broth

2.3 最佳發(fā)酵條件

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 豬血最佳發(fā)酵條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal experimental results of optimum fermentation conditions of pig blood

由表5可知，以發(fā)酵物中氨基酸態(tài)氮含量為評價指標(biāo)，其最佳組合為：A1B3C3D3，即給100 mL的豬血中加入15 g米曲霉，在60 ℃下反應(yīng)12 h；以臭味指數(shù)為評價指標(biāo)，其最佳組合為：A1B3C3D3，即給 100 mL 的豬血中加入5 g米曲霉，在60 ℃下反應(yīng)12 h。綜合考慮以上2個指標(biāo)，其最佳組合為：A1B2C3D3，即給100 mL的豬血中加入10 g米曲霉，在60 ℃下反應(yīng)12 h。

2.4 最佳酸解條件的確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

由表6可知，以氨基酸態(tài)氮含量為評價指標(biāo)，豬血酸解的最佳組合為：A2B2C2D3，即給100 mL的豬血中加入濃度為4 mol/L的硫酸10 mL，在90 ℃下反應(yīng)12 h；以臭味指數(shù)為評價指標(biāo)，豬血酸解的最佳組合為：A2B2C3D2，即給100 mL的豬血中加入濃度為 4 mol/L 的硫酸10 mL，在100 ℃下反應(yīng)8 h，綜合考慮以上兩個因素，其最佳組合為：A2B2C3D3，即給100 mL的豬血中加入濃度為4 mol/L的硫酸 10 mL，在100 ℃下反應(yīng)12 h。

表6 豬血最佳酸解條件正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental table of optimum acidolysis conditions of pig blood

2.5 放大實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。

表7 自制產(chǎn)品與國家標(biāo)準(zhǔn)品對照表Table 7 Comparison of home-made products with national standards

由表7可知：①新鮮豬血肥料化過程中，米曲霉經(jīng)活化、酶解、酸解可得到氨基酸態(tài)氮含量為 1.664 6 g/100 mL，臭味指數(shù)為0.2、氨基酸含量為11.8%、水不溶物含量為2.1%、pH值為5.4的氨基酸肥料，符合GB/T 17419—1998含氨基酸葉面肥料國家標(biāo)準(zhǔn)，克服了酶解法臭味大、施用難[12]及酸解法酸度高、污染大[13]的技術(shù)難題；②將米曲霉活化、酶解、酸解技術(shù)結(jié)合在一起，產(chǎn)品的氨基酸態(tài)氮含量大于單獨(dú)米曲霉活化、酶解與酸解的氨基酸態(tài)氮含量的總和，臭味指數(shù)明顯低于單獨(dú)活化、酶解與酸解工藝，說明采用米曲霉活化、酶解、酸解集成技術(shù)對新鮮豬血進(jìn)行處理對氨基酸態(tài)氮含量、臭味指數(shù)具有增效作用。

3 結(jié)論

豬血經(jīng)活化處理的米曲霉在60 ℃下酶解12 h，再加入10%的4 mol/L硫酸，在100 ℃下酸解12 h，可得到氨基酸態(tài)含量為1.664 8 g/100 mL、臭味指數(shù)為0.2、水不溶物含量為2.1%、pH值為5.4的液體肥料，該肥料符合國家含氨基酸葉面肥質(zhì)量(GB/T 17419—1998)。解決了酶法豬血氨基酸肥料臭味大、施用不便及酸法豬血氨基酸肥料酸度高、污染大的技術(shù)難題。