陳麗歡，谷炎培，張 英

(浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省食品加工技術(shù)與裝備工程研究中心，浙江 杭州 310058)

人體長(zhǎng)期或高劑量暴露于紫外輻射會(huì)導(dǎo)致如紅斑、燒傷、炎癥激活和皮膚癌等危害[1]。商業(yè)防曬產(chǎn)品分為物理防曬霜和化學(xué)防曬霜。物理防曬劑主要是氧化鋅和二氧化鈦，通過(guò)反射和散射來(lái)阻擋UV輻射，過(guò)程中產(chǎn)生ROS，具有細(xì)胞毒性、遺傳毒性。而化學(xué)防曬劑通常是與羰基結(jié)合的具有共軛基團(tuán)的低分子量芳香族化合物，這種化學(xué)結(jié)構(gòu)有利于π-π電子的躍遷，因此具有很強(qiáng)的紫外吸收作用，分為UVA和UVB類過(guò)濾器[2]。由于這些成分具有光穩(wěn)定性和毒性，可破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)[3]，同時(shí)長(zhǎng)期使用易對(duì)人體產(chǎn)生副作用[4]。因此開(kāi)發(fā)環(huán)保、廣譜、高效的防曬活性成分是目前研究的熱點(diǎn)。

竹葉黃酮(Bamboo-leaf flavone，BLF)是新型植物黃酮制劑，其主要功效成分為碳苷黃酮，包括四種特征性化合物：葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷[5]。竹葉黃酮在波長(zhǎng)為240～290 nm(帶II)和300～350 nm(帶I)處有兩條吸收帶，具有清除自由基、抗衰老、抗輻射、紫外吸收等多重生物學(xué)功效[6]，已部分應(yīng)用于保健食品和日化行業(yè)。但由于竹葉黃酮色澤深、精度低，限制了其在護(hù)膚品中的應(yīng)用[7]。

木質(zhì)素是自然界中唯一可直接提供芳環(huán)的可再生能源[8]，具有價(jià)格低廉、熱穩(wěn)定性好、可降解等特點(diǎn)[9-10]。木質(zhì)素含有酚、酮等紫外吸收基團(tuán)，在防曬領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用潛力[11-16]。但由于工業(yè)木質(zhì)素顏色較深、無(wú)規(guī)團(tuán)聚、表面極性不均勻等缺點(diǎn)[15]，限制了其在高端護(hù)膚品中的應(yīng)用。

為降低木質(zhì)素色澤，Lee等[17]在溫和條件下使用二氧六環(huán)萃取分離得到淺色木質(zhì)素(比約克曼木質(zhì)素)，其紫外吸收效果并未減弱[18]，但由于高能耗、低生產(chǎn)率，比約克曼木質(zhì)素難以大量生產(chǎn)；Zhang等[19]通過(guò)甲醇/水分餾和乙?；钄嘤坞x羥基，使木質(zhì)素的亮度值(L值)提高313.5%，然而其紫外吸收能力大幅減弱。木質(zhì)素作為天然的兩親聚合物，在適當(dāng)體系中可通過(guò)非共價(jià)力自組裝形成膠束[15]，顯著增強(qiáng)其紫外防護(hù)效果[12，15，20-21]。但單一的木質(zhì)素不足以達(dá)到預(yù)期的防曬效果。Qian等[22]認(rèn)為木質(zhì)素與商業(yè)防曬因子存在協(xié)同作用關(guān)系，極大增強(qiáng)其UV吸收率。

本文在前期研究基礎(chǔ)上，以高純度竹葉黃酮、改性木質(zhì)素磺酸鈉和殼聚糖為原料，通過(guò)自組裝制得具有更淺色澤、更強(qiáng)生物學(xué)活性的復(fù)合納米膠體球。同時(shí)對(duì)改性木質(zhì)素磺酸鈉基竹葉黃酮納米膠體球的觀、結(jié)構(gòu)和防曬性能進(jìn)行表征。以期在大幅度提升BLF70生物學(xué)活性和外觀色澤的同時(shí)，通過(guò)與木質(zhì)素的協(xié)同作用，獲得天然、綠色、安全的新型復(fù)合防曬功能因子。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

竹葉黃酮(RP-HPLC 法測(cè)得其4個(gè)碳苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為75.7%，BLF70)，實(shí)驗(yàn)室自提；木質(zhì)素磺酸鈉(LS)，杭州通利源科技有限公司；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；殼聚糖(CS)，美國(guó)麥克林公司；納米氧化鋅[含量>99.8%，(50±10) nm]、納米二氧化鈦(含量> 99.8%，40 nm)、BMDM(含量>98.0%)、OMC(含量>97.0%)，美國(guó)macklin公司；甲醇，色譜純，美國(guó) sigma公司；乙醇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；正己烷，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Centrifuge 5810 R型 超速冷凍離心機(jī)，德國(guó)eppendorf公司；Waters e 2695 高效液相色譜儀，美國(guó) Waters 公司；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；CS-10彩譜色差儀，中國(guó)彩譜公司；Zetasizer Nano ZS90 納米粒度及Zeta電位分析儀，英國(guó)Malvern公司；Gemini SEM 300場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡，德國(guó)Zeiss公司；Cary 60紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，美國(guó)agilent公司； Nicolet IS 50 傅里葉變換紅外光譜計(jì)，美國(guó)Thermo公司；DSC1 差示掃描量熱儀，瑞士Mettler公司；UV 3600紫外分光光度計(jì)(帶積分球)，日本Shimadzu公司。

1.2 方 法

1.2.1 木質(zhì)素磺酸鈉的改性與膠束化

參考Li[21]的方法，將60wt%的木質(zhì)素磺酸鈉水溶液和50wt%的CTAB乙醇溶液按溶質(zhì)質(zhì)量比2.82∶1均勻混合，形成陰陽(yáng)離子復(fù)合溶液；在攪拌條件下以1.2 mL/s的速率加入2000 mL水后靜置24 h，沉淀物冷凍干燥即得改性木質(zhì)素磺酸鈉壁材(LS/CTAB)。

將無(wú)水乙醇-正己烷體系作為膠體球形成條件。稱取一定質(zhì)量高純度竹葉黃酮(BLF70)和LS/CTAB溶于無(wú)水乙醇中，超聲溶解。在低速磁力攪拌的條件下，將正己烷通過(guò)恒流泵以一定速度滴入BLF70-LS/CTAB醇溶液中。繼續(xù)低速磁力攪拌10 min，得改性木質(zhì)素磺酸鈉基竹葉黃酮納米膠體球混懸液(NSLS/BLF)。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化NSLS/BLF的制備工藝參數(shù)。以BLF70包封率為響應(yīng)值，對(duì)LS/CTAB濃度(A)、LS/CTAB與BLF70質(zhì)量比(B)、溶液體系中正己烷含量(C)、恒流泵流速(D)進(jìn)行L16(44)正交實(shí)驗(yàn)，因素配置水平如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.2 NSLS/BLF的碳苷黃酮包埋效果評(píng)價(jià)

采用HPLC法測(cè)定NSLS/BLF對(duì)BLF70的包封率。色譜條件參考Zhang等[5]的方法并做適當(dāng)改進(jìn)：Luna C18色譜柱，波長(zhǎng)掃描范圍200～400 nm，定量波長(zhǎng)330 nm，柱溫35 ℃，流速 0.5 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，流動(dòng)相為甲醇(A)/水(B)，梯度洗脫條件為(體積分?jǐn)?shù))28% A 與 72% B(0～10 min)，48% A 與 52% B(10～40 min)。

配制0.01 g/L、0.05 g/L、0.1 g/L、0.5 g/L、1 g/L的BLF70標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾器過(guò)濾后，進(jìn)樣20 μL，采用用峰面積歸一化法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取3 mL NSLS/BLF懸濁液于截留分子量為10 kD的離心超濾管中，離心(4000 r/min)30 min后，取下部濾出液進(jìn)樣，按如下公式計(jì)算包封率(η)：

η=(m0-m1)/m0×100%

式中，η為包封率，%；m0為樣品中BLF70總質(zhì)量，mg；m1為樣品中游離BLF70質(zhì)量，mg。

1.2.3 NSLS/BLF的漂白

取殼聚糖(CS)溶于1%乙酸溶液中，加熱攪拌至 CS 完全溶解。將NSLS/BLF通過(guò)恒流泵以一定速度滴入CS溶液中，使CS ： LS/CTAB(m/m)分別為0%、0.5%、1%、3%、6%、12%、18%、24%。攪拌5 h后，真空冷凍干燥 48 h，得漂白后改性木質(zhì)素磺酸鈉基竹葉黃酮納米膠體球(NSLS/BLF/CS)。以亨特白度、外觀、復(fù)溶時(shí)間、復(fù)溶后外觀為指標(biāo)，考察不同CS添加劑量對(duì)NSLS/BLF/CS漂白效果和品質(zhì)的影響。

使用彩譜色差儀分析各個(gè)樣品的亨特白度。在3個(gè)隨機(jī)位置測(cè)量每個(gè)樣品的L(亮度)、a(紅色)和b(黃色)值，記錄并計(jì)算平均值。亨特白度(W)根據(jù)以下等式計(jì)算[23]：

式中，L、a、b是各個(gè)樣品的顏色值。

1.2.4 NSLS/BLF/CS的表征

紫外光譜：配制一定濃度的樣品醇溶液，吸取1.5 mL至石英比色皿，掃描波長(zhǎng)范圍為240～400 nm。波長(zhǎng)范圍 200～400 nm。FTIR：采用溴化鉀壓片法，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32次，掃描范圍為4000～400 cm-1。DSC：掃描范圍為20～350 ℃，升溫速度 10 ℃/min，氮?dú)饬魉?0 mL/min。粒徑及電位測(cè)定：采用粒徑及電位分析儀測(cè)定，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 NSLS/BLF/CS的紫外吸收活性

分別將BLF70(2.5%、5%、7.5%)、NSLS/BLF/CS(2.5%、5%、7.5%)與無(wú)防護(hù)作用的空白霜(水、甘油、礦脂、二辛基醚、聚二甲基硅氧烷、甘油硬脂酸酯、鯨蠟醇、甜扁桃油、PEG-30硬脂酸酯、生育酚乙酸酯、聚二甲基硅氧烷醇、苯甲醇、苯氧乙醇、甘油丙烯酸酯/丙烯酸共聚物、丙二醇、EDTA二鈉、氫氧化鈉、葵花籽油)混合后，置于磁力攪拌器上，在25 ℃下以250 rpm的攪拌速度避光攪拌5 h，得到含有不同防曬成分的防曬霜。

將3 M醫(yī)用膠帶黏貼在2 mm厚的干凈石英載玻片上，利用注射器將防曬霜樣品均勻點(diǎn)滴在膠帶表面，樣品在膠帶表面的分布為2 mg/cm2。將涂抹好樣品的玻片避光干燥20 min，利用紫外積分球檢測(cè)器對(duì)其掃描，測(cè)試紫外透過(guò)率。掃描波長(zhǎng)范圍為280～400 nm，取點(diǎn)間隔為1 nm，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試3次[24]。樣品的SPF值通過(guò)下列等式計(jì)算[25]：

式中，Eλ表示CIE紅斑光譜有效性；Sλ表示太陽(yáng)光譜輻照度；Tλ表示樣品的光譜透射率。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，計(jì)算結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 NSLS/BLF的制備參數(shù)優(yōu)化

采用用峰面積歸一化法制得BLF70標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

y=3.951300x-143420(r=0.996，n=5)

式中，y為BLF70峰面積；x為BLF70濃度，mg/mL。

正交實(shí)驗(yàn)中各組的包封率及其分析結(jié)果如表2所示。選取正交結(jié)果最優(yōu)條件A2B2C1D4、k值最優(yōu)結(jié)果A2B2C3D4進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。通過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)可知，正交最優(yōu)條件得出NSLS/BLF的平均包封率為(80.57±0.55)%，高于k值最優(yōu)條件平均包封率(70.45±0.97)%。因此優(yōu)化后NSLS/BLF的制備參數(shù)為：LS/CTAB濃度3 g/L、LS/CTAB與BLF70質(zhì)量比10:1、正己烷含量35%、恒流泵流速700 μL/s，此時(shí)包封率為(80.57±0.55)%，且各因素對(duì)包封率影響程度的主次順序?yàn)锽(LS/CTAB與BLF70質(zhì)量比)> A(LS/CTAB濃度)> C(正己烷含量)> D(恒流泵流速)。

表2 自組裝制備NSLS/BLF的正交試驗(yàn)結(jié)果及分析Table 2 Orthogonal experiment results of NSLS/BLF prepared by self-assembled

續(xù)表2

2.2 殼聚糖添加量對(duì)NSLS/BLF/CS色澤和質(zhì)構(gòu)的影響

如圖1(a) 所示，不添加CS的NSLS/BLF/CS白度極低，且凍干后呈針晶狀，極大限制其在高端化妝品中的使用。

如表3所示，CS添加量為0%～1% CS時(shí)，NSLS/BLF/CS白度具有顯著性差異，添加1%CS后樣品的亨特白度提高230.56%；同時(shí)NSLS/BLF/CS外觀從針晶狀轉(zhuǎn)變?yōu)榕钏煞勰?，且?fù)溶時(shí)間短、復(fù)溶后溶液保持均勻半透明狀。當(dāng)CS添加量為1%～24% CS時(shí)，NSLS/BLF/CS白度提高不明顯，且樣品外觀從蓬松粉末狀轉(zhuǎn)變?yōu)樾鯛睿瑥?fù)溶時(shí)間延長(zhǎng)、溶液混濁。

這說(shuō)明添加低濃度殼聚糖在改善色澤和質(zhì)構(gòu)上起重要作用。因此，CS的最佳添加量為1%。

表3 添加不同量殼聚糖對(duì)NSLS/BLF/CS色澤和質(zhì)構(gòu)的影響Table 3 Effect of the amount of CS on the color reduction and texture improvement of NSLS/BLF/CS

圖1 添加不同量殼聚糖(w/w)后NSLS/BLF/CS的外觀Fig.1 Appearance of NSLS/BLF/CS with different amount of CS

2.3 NSLS/BLF/CS的表征

2.3.1 NSLS/BLF/CS的組成

在最佳制備參數(shù)下(即LS/CTAB濃度3 g/L、LS/CTAB與BLF70質(zhì)量比10:1、正己烷含量35%、恒流泵流速700 μL/s、殼聚糖添加量1%)，BLF70的包封率為(80.57±0.55)%，此時(shí)NSLS/BLF/CS的組分構(gòu)成如下：7.2%～9%的竹葉碳苷黃酮，90.1%～91.8%的改性木質(zhì)素磺酸鈉，0.9%～0.91%的殼聚糖。

2.3.2 外觀、粒徑及電位測(cè)定

NSLS/BLF/CS的粒徑和電位分布曲線如圖2所示。NSLS/BLF/CS粒徑范圍為164～712 nm，重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)測(cè)得平均粒徑為(402.5±21.0) nm，多分散指數(shù)(PDI)為0.351±0.006，這說(shuō)明其分布較為均一。NSLS/BLF/CS的電位范圍為-33～-0.4 mV，平均電位為(-22.1±1.47) mV。

圖2 NSLS/BLF的粒徑和電位分布曲線Fig.2 Particle size distribution and average potential of NSLS/BLF/CS

NSLS/BLF/CS的SEM圖像見(jiàn)圖3。如圖3所示，NSLS/BLF/CS的形態(tài)規(guī)則，呈球形或類球形，大小較均勻。

圖3 NSLS/BLF的SEM照片F(xiàn)ig.3 SEM image of NSLS/BLF/CS

2.3.3 紫外光譜

圖4為BLF70、LS/CTAB 、NSLS/BLF/CS的紫外吸收光譜圖。如圖所示，LS/CTAB僅在280 nm出現(xiàn)最強(qiáng)吸收峰，而B(niǎo)LF70和NSLS/BLF/CS在270 nm和330 nm附近均出現(xiàn)典型竹葉碳苷黃酮帶Ⅰ和帶Ⅱ吸收峰，初步說(shuō)明BLF70與LS/CTAB發(fā)生交合作用。

圖4 BLF70、LS/CTAB、NSLS/BLF/CS的紫外吸收光譜圖Fig.4 UV absorption spectra of BLF70， LS/CTAB and NSLS/BLF/CS

2.3.4 紅外光譜

底物(BLF70、LS/CTAB)和產(chǎn)物(NSLS/BLF/CS)的紅外吸收光譜圖見(jiàn)圖5所示。NSLS/BLF/CS的主要特征峰包括：3424 cm-1的O-H伸縮振動(dòng)峰、2921 cm-1的C-H反稱伸縮振動(dòng)峰和 2851 cm-1的C-H對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，存在LS/CTAB的特征吸收峰，如1037 cm-1的芳醚=C-O-C對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰及其他彎曲振動(dòng)峰(1464 cm-1的烷烴-CH面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰、1425 cm-1的烯烴-CH面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰、1329 cm-1的-OH面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰)，同時(shí)存在部分BLF70的特征吸收峰，如1707 cm-1的C=O 伸縮振動(dòng)峰，1612 cm-1和1517 cm-1的苯環(huán)骨架振動(dòng)峰， 1116 cm-1的酚類ɑ-O 伸縮振動(dòng)峰，但這些特征吸收峰強(qiáng)度明顯降低，且彎曲振動(dòng)的指紋區(qū)域部分消失，如1459、1352和1077 cm-1等，這表明BLF70與 LS/CTAB分子間發(fā)生相互作用， LS/CTAB自組裝后包埋BLF70形成了納米膠體球。

圖5 BLF70 、LS/CTAB 、NSLS/BLF/CS 的紅外吸收光譜圖Fig.5 FTIR spectra of BLF70， LS/CTAB and NSLS/BLF/CS

2.3.5 差式掃描量熱分析

BLF70、LS/CTAB 和NSLS/BLF/CS的差式掃描量熱分析曲線圖見(jiàn)圖6所示。從圖中可知，三者均有兩個(gè)吸熱峰，分別為失水峰和熔融峰。BLF70的熔融曲線光滑，熔融溫度為112.58 ℃，熱焓值為 21.9 J/g；LS/CTAB的熔融曲線光滑，熔融溫度為254.05 ℃，熱焓值為 75.47 J/g；而NSLS/BLF/CS僅存在一個(gè)熔融峰，表明BLF70與LS/CTAB已通過(guò)自組裝形成均一膠體，這與紅外光譜分析結(jié)果一致；BLF70和LS/CTAB的相互作用提高兩者的穩(wěn)定性，因此NSLS/BLF/CS的熔融溫度提高至260.88 ℃，熱焓值提高至 82.54 J/g；NSLS/BLF/CS熔融曲線不光滑，可能是由于不同顆粒尺寸(164～712 nm)的熔融速率不同導(dǎo)致的。

圖6 BLF70 、LS/CTAB 、NSLS/BLF/CS 的差式掃描量熱分析曲線圖Fig.6 DSC spectra of BLF70， LS/CTAB and NSLS/BLF/CS

2.4 NSLS/BLF/CS的紫外吸收活性

如圖7 所示，防曬乳液的SPF值隨BLF70和NSLS/BLF/CS質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加，且含NSLS/BLF/CS的防曬乳液SPF值增速更快。當(dāng)兩者添加量均為7.5%時(shí)，含NSLS/BLF/CS防曬霜的SPF值是含BLF70的2.63倍，這說(shuō)明通過(guò)自組裝制得的NSLS/BLF/CS明顯提高了BLF70的防曬性能。

圖7 防曬霜的SPF 值與BLF70、NSLS/BLF/CS添加量的關(guān)系圖Fig.7 The SPF value of the pure creams blended with different amounts of BLF70 or NSLS/BLF/CS

3 結(jié) 論

本文將高精度竹葉黃酮與木質(zhì)素復(fù)配。對(duì)木質(zhì)素磺酸鈉疏水改性，于無(wú)水乙醇-正己烷體系中自組裝，在改善色澤的同時(shí)，解決了木質(zhì)素?zé)o規(guī)團(tuán)聚、表面極性不均勻等問(wèn)題。通過(guò)正交試驗(yàn)可知最佳制備參數(shù)為：LS/CTAB濃度3 g/L、LS/CTAB與BLF70質(zhì)量比10∶1、正己烷含量35%、恒流泵流速700 μL/s，此條件下納米膠體球包埋率為(80.57±0.55)%。將殼聚糖作為降色劑吸附于納米膠體球表面，當(dāng)添加量為1%時(shí)，納米膠體球的亨特白度提高230.56%。此納米膠體球有助于解決竹葉黃酮和木質(zhì)素在化妝品應(yīng)用中普遍存在的產(chǎn)品色澤差的問(wèn)題。含NSLS/BLF/CS防曬霜的SPF值是含BLF70的2.63倍，即通過(guò)自組裝制得的NSLS/BLF/CS明顯提高了BLF70的防曬性能，因此NSLS/BLF/CS在日化產(chǎn)品，尤其是防曬產(chǎn)品中具有良好的應(yīng)用前景。而納米膠體球與現(xiàn)有的物理、化學(xué)防曬劑是否存在協(xié)同作用，以及該納米膠體球的其他生物學(xué)活性有待進(jìn)一步探究。