黃利強(qiáng)

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，集美大學(xué)水域環(huán)境與漁業(yè)資源監(jiān)測(cè)中心，福建 廈門 361021)

亞硝酸鹽是水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中最常見(jiàn)的有害污染物之一。天然水體中的亞硝酸鹽一般濃度較低，但在高密度集約化養(yǎng)殖過(guò)程中，往往由于餌料殘留、硝化作用失衡等原因?qū)е滤w亞硝酸鹽超標(biāo)，引發(fā)水產(chǎn)動(dòng)物亞硝酸鹽中毒事故。亞硝酸鹽對(duì)魚類、軟體動(dòng)物和甲殼類等水生動(dòng)物均具有較強(qiáng)毒性，高濃度時(shí)可將水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白，使其發(fā)生急性缺氧窒息；濃度較低時(shí)雖不致急性中毒，但也會(huì)長(zhǎng)期影響水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)抗氧化酶活性，降低其免疫能力，進(jìn)而出現(xiàn)厭食、易發(fā)病、生長(zhǎng)緩慢等一系列不良癥狀，因此水產(chǎn)養(yǎng)殖中一般應(yīng)控制亞硝酸鹽濃度不高于0.15 mg·L-1[1-3]。而對(duì)養(yǎng)殖水體中的亞硝酸鹽濃度進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)及時(shí)監(jiān)測(cè)，有助于預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物亞硝酸鹽中毒，對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)具有重要的實(shí)際用途。

目前國(guó)內(nèi)外養(yǎng)殖水體中亞硝酸鹽的測(cè)定普遍采用經(jīng)典的重氮-偶氮比色法。其原理為，檢測(cè)試劑中的磺胺與水中亞硝酸鹽先進(jìn)行重氮化反應(yīng)，重氮化產(chǎn)物再與鹽酸萘乙二胺偶合生成紅色的偶氮產(chǎn)物，在一定范圍內(nèi)，產(chǎn)物紅色的深淺程度與亞硝酸鹽濃度成正比關(guān)系。該反應(yīng)非常靈敏，產(chǎn)物顏色也很穩(wěn)定，因此在亞硝酸鹽檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用。水樣顯色完成后可以用臺(tái)式、便攜式分光光度計(jì)、亞硝氮測(cè)定儀等儀器進(jìn)行測(cè)量[4-8]，結(jié)果精確，但是目前儀器成本還較高；也可以使用人工比色法，根據(jù)肉眼觀察產(chǎn)物紅色的深淺，與檢測(cè)試劑盒廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)比色卡進(jìn)行比對(duì)，即可估測(cè)亞硝酸鹽的大致濃度。人工比色法成本低廉，但是只能做半定量的估值，不能精確讀數(shù)；而且對(duì)于色盲、色弱等人員，就難以判斷紅色的深淺甚至有無(wú)；周邊環(huán)境亮度低時(shí)也會(huì)影響對(duì)顏色的判斷。此外由于只與比色卡進(jìn)行顏色的絕對(duì)比對(duì)、 沒(méi)有引入標(biāo)準(zhǔn)物對(duì)照，若試劑存放過(guò)久，顯色劑濃度下降之后，反應(yīng)物顏色會(huì)變淺，此時(shí)再與比色卡對(duì)比可能導(dǎo)致估值比實(shí)際值偏低。因此對(duì)于新型亞硝酸鹽檢測(cè)儀的研究屢見(jiàn)報(bào)道[9-11]。

本文根據(jù)比色法檢測(cè)水中亞硝酸鹽的原理，使用價(jià)格低廉的發(fā)光二極管(LED)作為光源和檢測(cè)器，設(shè)計(jì)和自制了一款簡(jiǎn)易便攜式亞硝酸鹽檢測(cè)儀，通過(guò)簡(jiǎn)單操作，即可直接讀出水中亞硝酸鹽的準(zhǔn)確濃度數(shù)值。

1 材料與方法

1.1 亞硝酸鹽檢測(cè)儀的工作原理和系統(tǒng)組成

本亞硝酸鹽檢測(cè)儀主要由光源、檢測(cè)器、電路板、數(shù)字電壓表等部分組成，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)原理如圖1所示，圖2為成品樣機(jī)圖。水中亞硝酸鹽與檢測(cè)試劑進(jìn)行重氮化反應(yīng)的產(chǎn)物在470～550 nm范圍內(nèi)吸光度較大(圖3)， 因此本文選用主波長(zhǎng)為530 nm的發(fā)光二極(LED)作為光源，檢測(cè)水樣對(duì)530 nm波長(zhǎng)光的吸收即可獲得良好的靈敏度。

圖1 亞硝酸鹽檢測(cè)儀原理圖Fig.1 Schematic diagram of nitrite detector

圖2 亞硝酸鹽檢測(cè)儀樣機(jī)圖Fig.2 Prototype of nitrite detector

圖3 亞硝酸鹽顯色反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜Fig.3 Absorption spectrum of products of nitrite color reaction

檢測(cè)器使用主波長(zhǎng)為600 nm的發(fā)光二極管LED，與光源LED一起組成對(duì)發(fā)光二極管對(duì)(PEDD)，不需光柵或?yàn)V光片即可選擇性地檢測(cè)530 nm附近的光信號(hào)。而且使用LED為檢測(cè)器時(shí)，可以產(chǎn)生伏特級(jí)的光電壓，接收到的光電信號(hào)不需放大，即可直接進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，因此這種基于PEDD的檢測(cè)儀具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、器件精簡(jiǎn)、成本低廉的特點(diǎn)[12-16]。系統(tǒng)電路原理如圖4所示。

實(shí)驗(yàn)所用2只LED均購(gòu)自深圳市春達(dá)鑫光電有限公司(燈珠直徑8.0 mm，額定功率1 W)，將530 nm LED作為發(fā)射光源(LED1)，600 nm LED作為光電檢測(cè)器(LED2)。3D打印的比色皿座在相對(duì)的兩面各開(kāi)有一個(gè)直徑3 mm的窗口，將LED1/ LED2分別固定在兩面的窗口上對(duì)準(zhǔn)即可，不需額外的聚光或?yàn)V光器件。為使光源LED發(fā)出的光強(qiáng)度穩(wěn)定，使用穩(wěn)壓電路78L05(U1)組成簡(jiǎn)易恒流驅(qū)動(dòng)電路，為 LED提供穩(wěn)定的工作電流。光源LED1發(fā)射出穩(wěn)定的530 nm光(即入射光，強(qiáng)度I0)照射樣品，檢測(cè)器LED2接收樣品的透射光產(chǎn)生光電壓V，光電壓的大小與透射光的強(qiáng)度It呈正比關(guān)系；再根據(jù)朗伯比爾定律：吸光度A=-lg(It/I0)=Kc(K為比例系數(shù)，c為試樣濃度)，對(duì)光電壓進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換、比例放大、電阻分壓之后，即可使數(shù)字電壓表的電壓值直接顯示樣品的亞硝酸鹽濃度數(shù)值。

圖4 亞硝酸鹽檢測(cè)儀系統(tǒng)電路原理圖Fig.4 Circuit diagram of nitrite detector

對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換電路使用價(jià)格低廉的雙運(yùn)放集成電路LM358(U2)與三極管Q1構(gòu)成，將LED2上產(chǎn)生的光電壓進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換后的輸出電壓送入U(xiǎn)2的第2個(gè)運(yùn)放進(jìn)行電壓放大，放大倍數(shù)由R3/R2(亦即R5/R4)控制；最后由RP2、R7組成分壓電路，調(diào)節(jié)RP2的阻值，可使數(shù)字電壓表的電壓值恰好與亞硝酸鹽濃度值相等。數(shù)字電壓表可以使用市售4位電壓表頭，體積較小，量程5 V即可，也可以選用普通萬(wàn)用表的電壓檔。如采用DT830萬(wàn)用表的2000 mV檔，當(dāng)電壓表顯示200 mV時(shí)，對(duì)應(yīng)的亞硝酸鹽濃度即為200 μg·L-1，即0.2 mg·L-1；有的萬(wàn)用表是2 V檔，此時(shí)顯示電壓為0.2 V，對(duì)應(yīng)的亞硝酸鹽濃度即為0.2 mg·L-1。

系統(tǒng)耗電較低，整機(jī)工作電流≤50 mA，可使用3.7 V鋰電池用升壓轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)成±12 V電壓后給整機(jī)供電。整機(jī)體積小巧，光路固定無(wú)移動(dòng)部件，易于戶外便攜使用。

1. 2 實(shí)驗(yàn)步驟

自制亞硝酸鹽檢測(cè)儀的操作步驟為：接通電源，放入空白溶液作為參比，調(diào)節(jié)RP1至數(shù)字電壓表顯示0 mV，即完成調(diào)零；接著放入0.2 mg·L-1亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，調(diào)節(jié)RP2至數(shù)字電壓表顯示200 mV(對(duì)應(yīng)200 μg·L-1的濃度)，即可完成斜率校正；當(dāng)測(cè)量樣品時(shí)，放入待測(cè)樣品，即可直接顯示樣品的濃度值(μg·L-1)。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)采用721分光光度計(jì)(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)為測(cè)量?jī)x器。實(shí)驗(yàn)均使用塑料一次性比色皿，光程均為10 mm。

亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液使用廣檢(廣州)檢測(cè)科技公司生產(chǎn)的亞硝酸鹽氮標(biāo)準(zhǔn)溶液(CNO2-N=1000 μg·mL-1) 用純凈水進(jìn)行稀釋和配制。亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液和水樣的顯色反應(yīng)均使用河南南華千牧生物科技有限公司生產(chǎn)的亞硝酸鹽水質(zhì)分析盒(檢測(cè)范圍0.005～0.2 mg·L-1)，按照廠家方法進(jìn)行顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確配制濃度在0.005～0.2 mg·L-1的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，用721分光光度計(jì)在530 nm處測(cè)定吸光度，繪制工作曲線。測(cè)定結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明標(biāo)準(zhǔn)系列的工作曲線具有優(yōu)異的線性特性(R2=0.9996)。證明使用此快速檢測(cè)試劑盒，在濃度≤0.2 mg·L-1的范圍內(nèi)，可以很好的符合朗伯比爾定律，即反應(yīng)物紅色的深淺程度與濃度符合線性關(guān)系。當(dāng)水樣中亞硝酸鹽濃度過(guò)大，吸光度過(guò)高，會(huì)偏離朗伯比爾定律導(dǎo)致測(cè)量誤差加大，并容易產(chǎn)生團(tuán)聚、絮凝現(xiàn)象，此時(shí)需用純凈水稀釋后再進(jìn)行檢測(cè)。

圖5 721分光光度計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(n=3)Fig.5 Standard working curve of 721 spectrophotometer(n=3)

2.2 系統(tǒng)性能測(cè)試

用自制亞硝酸鹽檢測(cè)儀對(duì)0.005～0.2 mg·L-1濃度范圍的亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度均測(cè)定3次取平均值，再繪制與真實(shí)值的關(guān)系曲線，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，在0.005～0.2 mg· L-1濃度范圍內(nèi)，測(cè)量結(jié)果緊密分布在 45°線周圍，R2=1，可見(jiàn)本儀器的測(cè)定值與標(biāo)準(zhǔn)溶液的真實(shí)值高度吻合，具有良好的準(zhǔn)確度。對(duì)幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)量值與真實(shí)值的相對(duì)誤差在-0.44%～2.00% 之間，絕對(duì)誤差均<1 μg·L-1， 說(shuō)明本檢測(cè)儀能夠較準(zhǔn)確地檢測(cè)水中亞硝酸鹽含量。

圖6 亞硝酸鹽檢測(cè)儀測(cè)定值與真實(shí)值的比較(n=3)Fig.6 Comparison of actual concentration values with measurement value by nitrite detector(n=3)

使用自制亞硝酸鹽檢測(cè)儀和721分光光度計(jì)同時(shí)對(duì)2份養(yǎng)殖水樣中的亞硝氮進(jìn)行測(cè)定，721分光光度計(jì)使用0.005～ 0.2 mg·L-1的亞硝氮標(biāo)準(zhǔn)系列溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用工作曲線法進(jìn)行定量；自制亞硝酸鹽檢測(cè)儀按1.2方法，用0.2 mg/L標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正后直接讀取濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 養(yǎng)殖水樣亞硝酸鹽測(cè)定結(jié)果對(duì)比(n=3)Table 1 Comparison of determination results of nitrite in aquaculture water sample(n=3)

表1中列出了721分光光度計(jì)與自制亞硝酸鹽檢測(cè)儀對(duì)2份養(yǎng)殖水樣中亞硝酸鹽的檢測(cè)結(jié)果，結(jié)果表明兩種儀器的測(cè)量結(jié)果相當(dāng)接近，2種儀器間的測(cè)量結(jié)果相對(duì)偏差均<5%，表明本檢測(cè)儀對(duì)實(shí)際水樣也具有較好的測(cè)量準(zhǔn)確度。此外對(duì)空白溶液進(jìn)行了11次測(cè)定，依據(jù)空白值標(biāo)準(zhǔn)偏差Sd的3倍除以斜率K，求得本檢測(cè)儀對(duì)亞硝酸鹽的檢測(cè)限(3Sd/K)為0.002 mg·L-1，可以滿足普通水產(chǎn)養(yǎng)殖等應(yīng)用場(chǎng)合的需要。

3 結(jié) 論

本文根據(jù)重氮-偶氮比色法測(cè)定亞硝酸鹽的原理，設(shè)計(jì)了一種基于PEED的便攜式亞硝酸鹽含量檢測(cè)儀，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成本低廉，體積小巧，測(cè)量快速準(zhǔn)確，適合水產(chǎn)養(yǎng)殖、環(huán)境監(jiān)測(cè)、工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、家居生活等眾多場(chǎng)合的低成本亞硝酸鹽快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。