張 亮 王鳳鹿 李小強(qiáng) 王林林 陳 鵬 蔣小兵 趙?？?/p>

膠質(zhì)瘤是發(fā)病率非常高的原發(fā)性腦腫瘤，惡性膠質(zhì)瘤占一半以上[1]，預(yù)后非常差，即使選擇手術(shù)進(jìn)行最大限度切除及聯(lián)合放化療治療，仍難以提高惡性膠質(zhì)瘤的預(yù)后[2]，中位生存期只有15 個(gè)月左右[3]。白藜蘆醇是一種天然多酚，對腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展具有顯著的抑制作用[4]。CD44 是一種跨膜蛋白，定位于細(xì)胞膜，參與細(xì)胞遷移、細(xì)胞粘附以及細(xì)胞間相互作用等，其表達(dá)異常與腫瘤惡化具有密切聯(lián)系[5]。本文探討白藜蘆醇對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲的影響及CD44在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料U251 細(xì)胞購自上海一研生物科技有限公司；胎牛血清和RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；白藜蘆醇購自上海源葉生物科技有限公司；Lipofectamine2000TM 脂質(zhì)體購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Takara公司；廣州銳博生物科技有限公司合成引物；Transwell 小室購自美國Coming-Costar 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）購自日本Dojindo公司，CD44、Cyclin D1、CDK4、MMP2、MMP9、GAPDH抗體購自英國Abcam公司，二抗購自美國ThermoFisher Scientific公司；引物和siCD44（GGACCUCUUUCAAUGACAATT）購自生工（上海）生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將U251 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞生長密度接近90%時(shí)，利用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液。收集細(xì)胞待用。

1.3 白藜蘆醇干預(yù) 將單細(xì)胞懸液接種96孔板，每孔100 μl，加入白藜蘆醇，濃度分別為0 μmol/L（空白對照組）、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L，培養(yǎng)48 h 進(jìn)行細(xì)胞增殖和侵襲檢測，根據(jù)結(jié)果選擇最佳濃度進(jìn)行CD44干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將U251細(xì)胞懸液接種6孔板，密度5×104個(gè)/孔。參 考Lipofectamine2000TM 說 明 書，將pcDNA3.1/CD44（CD44 過表達(dá)）、pcDNA3.1（過表達(dá)對照）等質(zhì)粒轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將U251 細(xì)胞接種96 孔板，按照操作說明書，每孔加入10 μl CCK-8溶液繼續(xù)孵育2 h，然后用酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光值。

1.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將基質(zhì)膠涂布于侵襲小室上室，U251 細(xì)胞接種于下室，正常培養(yǎng)24 h，去除上室中的培養(yǎng)液，擦除未發(fā)生侵襲的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，利用0.1%濃度的結(jié)晶紫染色試劑進(jìn)行處理，顯微鏡下拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，記錄視野下發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)量。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測mRNA 表達(dá) 收集培養(yǎng)的U251 細(xì)胞，利用Trizol 試劑盒根據(jù)說明書提取細(xì)胞總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)說明書合成cDNA，利用RT-PCR 試劑盒根據(jù)說明書檢測mRNA。PCR條件：96 ℃、4 min，95 ℃、20 s，56 ℃、10 s，72 ℃、15 s，35 個(gè)循環(huán)。運(yùn)用2-ΔΔCt法分析相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 PCR檢測引物序列

1.8 免疫印跡法檢測蛋白表達(dá) 收集待檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞，利用細(xì)胞裂解液將細(xì)胞完全裂解，12 000 轉(zhuǎn)/min、4 ℃條件下離心15 min，收集上清液，利用BCA方法測定蛋白液濃度。利用SDS-PAGE電泳分離目的蛋白并轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。加入一抗（1:1 000）常溫孵育1 h，再加入辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗常溫孵育1 h（1:10 000），ECL試劑盒顯影定影，拍照并記錄。內(nèi)參蛋白為GAPDH。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS 20.0軟件處理；定量資料以±s表示，采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對U251 細(xì)胞增殖及侵襲的影響 與空白對照組相比，白藜蘆醇明顯抑制U251細(xì)胞的增殖和侵襲能力（P＜0.05；圖1、2），而且呈濃度依賴性（P＜0.05；圖1、2）。所以，用150 μmol/L 白藜蘆醇進(jìn)行CD44干預(yù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 白藜蘆醇對U251細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 白藜蘆醇對U251 細(xì)胞CD44 表達(dá)的影響 與空白對照組相比，白藜蘆醇明顯抑制U251 細(xì)胞CD44 mRNA 和蛋白表達(dá)（P＜0.05；圖3），而且呈濃度依賴性（P＜0.05；圖3）。

圖3 白藜蘆醇對U251細(xì)胞CD44表達(dá)的影響

2.3 白藜蘆醇對U251 細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組相比，白藜蘆醇明顯抑制U251 細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路（Cyclin D1、CDK4）以及細(xì)胞侵襲相關(guān)信號通路（MMP2、MMP9）mRNA 和蛋白表達(dá)（P＜0.01；圖4），而且呈濃度依賴性（P＜0.05；圖4）。

圖4 白藜蘆醇對U251細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)信號通路蛋白表達(dá)的影響

2.4 CD44過表達(dá)對白藜蘆醇作用的影響CD44過表達(dá)明顯抑制白藜蘆醇對膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用（P＜0.05；圖5）。

圖5 CD44過表達(dá)對白藜蘆醇作用的影響

3 討論

圖2 白藜蘆醇對U251細(xì)胞侵襲能力的影響

白藜蘆醇是一種植物抗毒素，在漿果、花生及葡萄等植物中廣泛存在[6]。白藜蘆醇對人體的心腦血管具有保護(hù)作用，同時(shí)具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎和抗氧化等作用[7]。Sun 等[8]研究顯示，白藜蘆醇顯著增強(qiáng)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的治療效果，參與調(diào)控皮膚鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程。Subedi等[9]報(bào)道顯示，白藜蘆醇調(diào)控MAPK/PI3K 信號通路，抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，同時(shí)明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Khusbu 等[10]研究顯示，白藜蘆醇顯著抑制TRAF6的表達(dá)，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。Yang等[11]研究顯示，白藜蘆醇抑制T98G 和U138 膠質(zhì)瘤細(xì)胞Wnt2 和βcatenin的表達(dá)，從而抑制Wnt信號途徑的活性，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇顯著下調(diào)CD44 表達(dá)，明顯抑制膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞的增殖和侵襲。CD44在細(xì)胞中具有兩種作用，分別為淋巴細(xì)胞歸巢受體和透明質(zhì)酸受體，參與炎癥、血管再生、細(xì)胞粘附以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等[12]。Vanje 等[13]研究顯示，釉母細(xì)胞瘤CD44 異常高表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的發(fā)展過程。Guo等[14]報(bào)道顯示，非小細(xì)胞肺癌CD44 表達(dá)異常升高，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)CD44 過表達(dá)可逆轉(zhuǎn)白藜蘆醇對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用，表明CD44高表達(dá)對膠質(zhì)瘤具有促進(jìn)作用。Hu等[15]研究顯示，CD44在乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。Wang 等[16]研究顯示，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞CD44表達(dá)異常上調(diào)，并且CD44過表達(dá)促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及細(xì)胞干性發(fā)展。

此外，本研究結(jié)果顯示白藜蘆醇明顯抑制膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞CyclinD1、CDK4、MMP2、MMP9 等 表達(dá)。Zhang 等[17]研究顯示，當(dāng)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK4 的表達(dá)降低時(shí)，細(xì)胞增殖受抑制。這提示白藜蘆醇抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖，可能與下調(diào)CyclinD1、CDK4 的表達(dá)有關(guān)。Li 等[18]研究顯示，膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP2的表達(dá)水平下降時(shí)，細(xì)胞的增殖和侵襲能力也受顯著影響。Dai等[19]研究顯示，腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞MMP9 的表達(dá)水平下調(diào)時(shí)，細(xì)胞的增殖和侵襲能力顯著下降，并且腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡水平顯著上升。另有研究表明，在人急性髓系白血病細(xì)胞中，CD44 活性下調(diào)時(shí)，細(xì)胞CyclinD1、CDK4 的表達(dá)水平下調(diào)，影響細(xì)胞的增殖[20]。此外，腎癌細(xì)胞CD44 表達(dá)上調(diào)，通過促進(jìn)MMP2 和MMP9 調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[21]。

綜上所述，白藜蘆醇明顯抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲，其機(jī)制可能與下調(diào)CD44 的表達(dá)，進(jìn)而抑制CyclinD1、CDK4、MMP2、MMP9的表達(dá)有關(guān)。